Une approche écotoxicologique et génotoxicologique des sédiments de l’étang de Berre • Programme ECCOREV : 2008-2009 • Programme BERTOX: INSU-EC2CO, 2010-2011 The berre lagoon, in the south of France near Marseille, has been impacted for many decades by inputs of organic and inorganic contaminants issued from industries and urbanisation.

Concentrations en Pb en surface du sédiment - 1976 1966 - Les apports d’eau douce par le canal EDF diminuent la salinité de l’étang (31-36‰ to 4-33‰) et induisent la stratification des eaux et des phénomènes d’anoxie au fond Concentrations en Pb en surface du sédiment - 1976 [Giorgetti, 1981] Biocœnose benthique en 2006 Lagunaire eurytherme euryhalin LEE dégradé Pas de macrobenthos As an exemple, you can see here the values of lead concentration measured in surface of the sediment in ninety seventy-six, reaching up to 300 ppm for a local background around fifteen. In nineteen sixty six, the set-up of an hydroelectric power plant impacted also the salinity range and favored by stratification anoxic conditions in bottom water. The lagoon ecosystem was destabilized and shifted from one hundred species to less than fifteen now. Benthic species are still absent from a large part of the central area. Gipreb (2007) 101 espèces benthiques en 1949 moins de 15

Des approches intégrées de gestion de la zone côtière sont conduites sur le site depuis 10 ans, et la salinité s’est accrue grâce à la diminution par étape des rejets d’eau douce. Est ce que les contaminants présents dans le sédiment peuvent affecter la restauration espérée de l’écosystème benthique ? 1) Mesurer les métaux et contaminants organiques dans les sédiments de surface Évaluer leur biodisponibilité Définir et analyser des biomarqueurs adéquats pour les organismes présents 4) Évaluer l’activité génotoxique et mutagénique des sédiments Première approche Biomarqueurs : signature biologique de l'impact (actuel ou passé) ou de la présence d'un xénobiotique dans l'organisme, ou de l'effet induit d'un changement ou stress environnemental (ex : pollution thermique, pollution lumineuse induisant, déshydratation, perturbateur endocrinien..), et non la mise en évidence directe de la cause

Métaux dans les sédiments de surface (ppm=µg/g) B-SA V-Nord 1976 B-SA V-Nord V-cent V-aero Les teneurs ont diminué de 30 à 90% depuis 1970 Contamination modérée jusqu’à 3 fois le bruit de fond naturel dans Vaine Maxima à V-Nord et V-Centre We collected three sites on the most contaminated area, which is the Vaine lagoon here in the right, and one used as a control in the lowest contaminated zone in the north. You can see here some of the metals contents of the surface sediment. These concentrations have decreased by 30 to 90 % compared to the seventy’s due to industrial releases regulation but also accumulation and mixing. They are now similar in the north to the natural local background indicate by the red line, and a little bit higher in the Vaine lagoon. Fond géochimique naturel (FGN)

Métaux (ppm) extraits à pH4, pH6 et avec l’EDTA • pH physiologique des tubes digestifs de mollusques ou polychaetes • EDTA métaux fixés sur certains minéraux et supposés plus biodisponibles Grande variation entre les extractions To estimate the lability or bioavailability of these metals we decided to focus on three kind of extractions, one usual with EDTA, a strong chelatant agent, and two at pH4 and pH6 which corresponds to the physiological pH prevailing in the digestive tracts of molluscs and polychaete. We obtained very large variations between the extractions, but the maximum values were always observed in Vaine center and north. One of the point for which we still have no explanation is the high extraction of Copper and mercury by EDTA, perhaps due to a link with organic matter. Maxima à V-Nord et V-centre EDTA pH4 pH6

Covariation avec l’extraction EDTA Métaux dans Hediste Succinea Polychaete déposivore RC BH SE BWE BS RC ~ 4000 ppm BH SE BWE BS Contamination faible à modérée Maxima à V-Centre SE RC BH BWE BS Pas de relation avec les teneurs totales du sédiment ou extraites à pH4-6 Metals contents were also analysed in the whole bodie of hediste succinea. When compared with values reported for Atlantic sites by these authors, you can see that the contamination is low to moderate in our site except for zinc, but the maximum values is also found in V-cent. Obviously we do not have sufficient values to perform statistics but there is no clear relation with values obtained from total sediment or pH4 and 6 extractions, but it seems that there is a covariation with EDTA extraction (which is also right for DGT experiment). Covariation avec l’extraction EDTA Site fortement contaminé

Biomarqueur de défense Métallothionéine dans Hediste Succinea (méthode ELISA) Sections congelées parois intestinales Les MT sont des protéines enzymatiques impliquées dans les processus de détoxification des métaux. Elles sont aussi marqueurs de stress. V-AERO: Faible concentration (0,016 µg/mg prot) Biomarqueur de défense MT sur un seul site et pas de relation avec les teneurs totales ou extraites en métaux We evaluated the methallotionein content of these organisms as a biomarker, because MT are non enzymatic protein which are thought to be involved in detoxification of excess metal amounts. These proteins were evaluated by the ELISA method which prooved to be efficient and rapid and here you can see the results of MT content obtained from a control induction made by exposition of Hediste at various concentrations of copper sulfate. However, the MT were undetected in the in situ organisms except for V-aero where we found very low concentration. Here you see the MT protein highlit-ghted in the intestinal walls of the Hediste. This could be due to a contamination to low to induce MT and also to other detoxification processes which seem to exist for this polychaete. Biomarqueur : PARAMÈTRE MESURABLE QUI EXPRIME UNE RÉPONSE BIOCHIMIQUE, PHYSIOLOGIQUE OU PATHOLOGIQUE DANS UN ORGANISME  EXPOSITION AUX CONTAMINANTS ET/OU EFFET SUBLÉTHAL 1 - Contamination ou biodisponibilité trop faible pour induire des MT. 2 – variations temporelles 3 – autres processus de détoxification BSA, V-CENT, V-NORD: Pas de détection

concentrations SPCB and SHAP en surface du sédiment Marseille ≈ 270 µg/Kg Marseille ≈ 12600 µg/Kg The total PCB contents and Total polyaromatic hydrocarbon content are reported here, together with the natural background and the values measured in the bay of Marseille. They indicate a moderate contamination except however for V-cent, Surprisingly the PAH content in the north was quite elevated, but the molecular ratios of the PAH indicate a different source. Contamination typique des zones côtières affectées par des apports urbains et industriels HAP pétrogénique sur BSA, pyrolitique sur Vaine PCB d’origine différentes Dans Vaine et BSA

Activité mutagénique et génotoxique des sédiments TEST DES COMÈTES = mutation ponctuelle de l’ADN (Souches pour métaux, nitroarenes et HAPs/aromatic amine) TEST D’AMES = mutation ADN majeure(irreversible / transmissible) = effet mutagénique TESTE DES MICRONOYAUX = lésion primaire de l’ADN (réversible/non transmis) Tests réalisés : - Sur chaque site sur différentes extractions (pH4, pH6, deux protocoles pour conta. organique) 4 doses tests avec et sans activateur métabolique pour différencier les génotoxines directes ou indirectes. And finally, we assessed the genotoxicity and mutagenicity of the sediment using various in vitro short term bioassays: Le test des comètes, fait sur des cellules en culture et qui montre l’induction de lésion primaire de l’ADN Le test d’ames fait sur des bactéries et qui donne une indication de mutation ponctuelle engendrée dans l’adn Et le test des micronoyaux sur cellules qui traduit une mutation majeure de l’adn allant jusqu’à un effet mutagénique, cad qui se répercute These assays were performed on each site and on various extractions protocols both for metal and organic contaminants. They were always tested at four different doses, as you can see here on this exemple of results obtained from ph6 extraction, and they were also tested with and without metabolic activation using the S9 mixture which differentiate direct and indirect acting genotoxin mutagène est un agent chimique qui changent l'information génétique (habituellement ADN ) de l' organisme et augmente ainsi la fréquence de mutations au-dessus du niveau de fond nature. Les agents mutagènes sont en général également carcinogènes .

(hexane/dichloromethane)   B-SA1 V-AERO V-CENT V-NORD Extraction métaux pH4 Ames - + Comet MNC pH6 Extraction organique (hexane/dichloromethane) SANS Activation métabolique AVEC • Effets génotoxiques des “métaux” observés sur les deux sites les plus contaminés. • Effets génotoxiques des contaminants organiques observés uniquement avec l’activation métabolique. Le plus fort potentiel génotoxique n’est pas observé sur le site où les teneurs en HAP sont les plus fortes. • Un deuxième protocole d’extraction indique que les dérivés comme les nitroarènes et les amines aromatiques sont impliqués dans l’activité génotoxicité globale. This table report the main results obtained from these assays. The sign indicate positive or no respons and colors give an indication of its significance. The main results are summarized the fact that: The two sites with the highest pAH and PCB contents revaled genotoxic and mutagenic effects with a positive dose-response relationship, but only with metabolic activation. And the strongest genotoxicity is not observed for the most polluted site, which is V-cent. For the metals extract, the responses are correlated for both pH and genotoxic effects were also found for the most polluted sites. There is thus a relation between the genotoxicity effects of sediment and contaminants contents, but it is not linear . Results from a second extraction protocol for organic contaminant not presented here confirmed that there is a mutlifactorial aspects of sediment mutagenicity and that nitroarenes and aromatic amines are probably greatly involved in the global genotoxic hazard. Thus total PAH or PCB content are probably not the best indicator for this effect. Il apparaît une relation entre génotoxicité et contaminants, mais elle n’est pas relié aux seules valeurs de concentrations

Programme Bertox-INSU 2010-2011 La réponse des tests de toxicité est en accord avec les teneurs en multi-contaminants, mais aucune relation directe n’apparaît. Deuxième approche : BERTOX - Définir les interactions saisonnières entre la macrofaune, la bioturbation, les communautés bactériennes et la physico-chimie du milieu (sédiment et eaux interstitielles). Préciser l’influence des contaminants en étudiant: • Le comportement et la santé d’espèces sentinelles • La partition et la biodisponibilité des contaminants • Lévolution temporelle de biomarqueurs • Les marqueurs de génotoxicité dans les organismes To conclude, I will say that the responses to the toxicity tests realized in this preliminary work are in rather good agreement with the multi-contaminants contents measured in the sediment, but there is no direct relation and we are far from getting an answer to the question of the influence of such multi-contaminants exposition on the restoration of benthic ecosystem, but we just start a new project

Phases minérales solides Eaux interstitielles Site Vaine Centre

Biomarqueurs de défense et dommage chez H. Succinea Diversité taxonomique et fonctionnelle des microflores du sédiment et des organismes Activité en GST et LDH (biotransformation des polluants organiques et état métabolique) Métabolisme énergétique Activité des systèmes antioxydants et de résistance multixénobiotiques cellule Oxydative stress Métaux ERO ADN extrait des sédiments Activité Enzyme Antioxydante Test des comètes sur prélèvements intestinaux de H. Succinea Glutathion-S-Transférases (Biotransformation des polluants organiques lactate déshydrogénase (état métabolique de l’organisme) ROS : reactive oxyde species B9 V-Nord V-centre

Merci de votre attention O. Radakovitch, S. Rigaud, JM. Garnier E. Strady, B. Angeletti. X. Moreau, L. De Jong, A. Thiéry , C. Gueydon, L. Malleret, P. Doumenq, C. Di Giorgio, M. De Méo CEREGE - Aix Marseille université IMEP-BBE - Aix Marseille université ISM2-AD2EM Aix-Marseille université LBME - Faculté Pharmacie Marseille Deflandre B., Maire O., Delgard M.L., Mouret A., Ciutat A., Poirier D., Bichon S., Gremare A. Metzger E. Ghiglione J.F. Mirleau P. J.P. Amiard, PE Buffet Bernard G., Mayot N., Grisel R EPOC – Bordeaux BIAF – Angers OOB – Banyuls IMEP-EMB Aix marseille université MMS – Nantes GIPREB