Les techniques de la biologie moléculaire

Introduction

"Chercher une aiguille dans une meule de foin" ? Chercher à repérer un gène particulier dans un génome entier, qui en contient jusqu'à des centaines de milliers, c'est un peu comme chercher une aiguille dans une meule de foin...

Les techniques de la biologie moléculaire La réponse a ce problème : Les techniques de la biologie moléculaire

L’électrophorèse

L’électrophorèse des acides nucléiques Déplacements de fragments d’acides nucléiques chargés selon leur taille sur un gel soumis a un champ électrique

Le gel utilisé L’agarose pour L’acrylamide pour les les fragments d’ADN de taille (0,5-20kb) L’acrylamide pour les fragments de moins de 1000 paires de base

L’électrophorèse en champs alternées Principe On change périodiquement l’orientation du champ par a port au gel ,lors du changement de l’orientation du champ électrique l’acide nucléique change le sens de son orientation .

Visualisation par autoradiographie

Séparer, analyser ou purifier des But Séparer, analyser ou purifier des acides nucléiques

Remarque Les fragments d’acides nucléiques peuvent être séparer selon leur structure ;par exemple les différents formes d’un plasmide (ouvert ,linéaire ,surenroulé)

Remarque Elle permet aussi d’étudier des interactions des acides nucléiques avec des protéines

La centrifugation Rtyuiloù

Centrifugation en gradient de saccharose Principe: Séparer les macromolécules selon leur poids moléculaire et/ou leur forme

Utilisations majeurs Purification des phages Sélection des fragments d’ADN voulus Isolement des polysomes Fractionner les ARN (ARNm, ARNt,…)

Un exemple d'utilisation de la centrifugation zonale : le fractionnement de molécules d'ARN

Centrifugation en gradient de chlorure de césium /Centrifugation isopycnique (gradient continu) Utilisation d’une: Solution de chlorure de césium(CsCl)

Exemple: La purification des plasmides Utilisations majeurs Préparation de plasmides et de phages Exemple: La purification des plasmides

2/ .Centrifugation sur coussin (gradient discontinu)

Utilisation majeure préparation rapide et à grande échelle des phages ou des virus de densité connue.

Un exemple d'utilisation de la centrifugation sur coussin : la purification des phages

La PCR

Historique En 1960 dans les sources de Yellowstone aux U.S.A. « Thermus aquaticus » est découverte vivant à 70°C, trente ans plus tard son ADNpoly <Taq > est utilisée dans la PCR (La revue Sciences décernait sa 1ere distinction de molécule de l’année à la Taq polymérase)

Définition PCR « polymérase chain reaction ») technique d’amplification in vitro mis au point par le chimiste Kary MULLIS en 1985 ( Prix Nobel 1993)

Faire progresser nos capacité Principe Faire progresser nos capacité d’analyse des gènes

Composés utilisés L’ADN matrice Amorces d’oligonucléotides Une ADN polymérase Des désoxyribonucléotides triphosphate (dNTP)

Déroulement des cycles d’amplification La dénaturation L’appariement des primers Elongation Schéma de la PCR 

Applications La PCR a apportée d’importantes contributions dans beaucoup de domaines: Les maladies héréditaires La recherche contre le cancer Les sciences médico-légales Les biotechnologies

L’hybridation

Généralités Les techniques de l’hybridation reposent sur : Complémentarité des bases successives de l’ADN La réversibilité du processus de séparations deux brins d’ADN

Les cas possibles pour une hybridation Hybridation stable (100%) Pas d’hybridation Hybridation partielle (50%)

But Repérer une molécule d’ADN ou d’ARN spécifique dans une population hétérogène

Les différentes techniques d’hybridation Hybridation ADN/ADN : Southern blotting Hybridation ARN/ADN : Northern blotting Hybridation Dot-blotting et slot-blotting

Southern Sonde ADN Cible ADN (nucléaire, phagique plasmidique ou autres,…)

Northern Sonde ADN Cible ARN

Dot-blotting & Slot-blotting Sonde ADN Cible ARN ou ADN Monocaténaire

Conclusion Grace aux techniques de la biologie moléculaire les chercheurs ont pu établir une partie de la carte des gènes humains, et espèrent obtenir le séquençage de tous le génome humain a des fins thérapeutique, médicales, a titre de prévention

Référence *Cours de l’institut national de recherche pédagogique *Biologie moléculaire PCEM 1 2006-2007 Université de Paris –VI Faculté de Médecine Pierre et Marie Curie *Comprendre la biologie moléculaire V. Laudenbach’, (2), J. Mantz(1), J.M. Desmontsl(1) (1) ‘Département d’anesthésie-réanimation chirurgicale, hôpitaux Bichat-Claude Bernard-Robert Paris ; (2)Laboratoire de neurologie du développement Paris * Thèse de Licence d’informatique Année 2001-2002 Option : Introduction à la biologie moléculaire *Principes des techniques de biologie moléculaire 2° édition Par D. Tagu, C.Moussard, éds (I.N.R.A. de Paris) *Article du magazine La recherche édition spéciale < Les frontières du vivant > N°317 Février 1999 * Participation à l’établissement d’une phylogénie moléculaire de requins d’eau profonde de l’ordre des Squaliformes de L’Université de Nantes Département Sciences et Techniques Alimentaires Marines *L’essentiel en génétique Edition : BERTI *Biochimie génétique biologie moléculaire de Jacqueline Etienne & Eric Clauser Edition Masson *Principe de génie génétique 6° édition ; édition De Boeck