Les infections à cytomégalovirus MC Mazeron octobre 2006

FAMILLE DES HERPESVIRIDAE SOUS FAMILLE Espèce Alpha-herpesvirinae Herpès simplex type 1 HHV1 Herpès simplex type 2 HHV2 Varicelle-zona HHV3 Beta-herpesvirinae Cytomégalovirus HHV5 Herpès virus humain 6 HHV6 Herpès virus humain 7 HHV7 Gamma-herpesvirinae Epstein-Barr HHV4 Herpès virus humain 8 HHV8

Cytomégalovirus Epidémiologie Réservoir : strictement humain Virus ubiquitaire Séroprévalence élevée dépend des : conditions socio-économiques 100% dans régions du tiers-monde où l ’infection est acquise très tôt dans la vie 50% en France habitudes sexuelles (MST)

Glycoprotéines d ’enveloppe Enveloppe phospholipidique Tégument Capside icosaédrique Protéines de la nucléocapside (Polyamines) La particule est composée d’un mélange de protéines virales et de protéines cellulaires. Le tégument comprend deux protéines très majoritaires : UL83 (pp65) UL32 (pp150), autres protéines présentes dont la pp71 (UL82) Capside : 2 protéines principales :la majeure MCP (pUL86, p150) la mineure mCPpUL85 (p35), pUL46(mCP-bp) se lie à la mCP Enveloppe : dérivée des membranes endosomales de la cellule infectée, est hérissée de glycoprotéines. La particule virale contient également des ARNmessagers d’origine virale et cellulaire. ADN linéaire double brin 230Kpb 150-200nm

Génome du cytomégalovirus. Localisation des gènes UL97 et UL54. UL54 UL97 UL US TRL: Répétition terminale longue, IRL : Répétition interne longue IRS : Répétition terminale courte, IRL : Répétition interne courte UL : Région unique longue, US : Région unique courte, région a 230 kb, 200 cadres de lecture ouverts Génome du cytomégalovirus. Localisation des gènes UL97 et UL54.

EPIDEMIOLOGIE DES SOUCHES DE CMV Profils de restriction Rsa I de UL10-13 A 1 2 3 4 5 M

ANALYSE D'UNE SEQUENCE DE UL55 Hinf I Rsa I 239 202 97 67 63 36 1 2 3 4 T D A M 1 2 3 4 T D A Chou and Dennison, JID, 1991

9 8 1 gM pp65 pp71 3 5 7 gB, gH Golgi 2 6 4 IE E L noyau cytoplasme

EA IEA LA Cycle de réplication EA : ADN pol, UL44, Hélicase, DNAse gpUL55 etc… LA : struct IEA : UL122-123 UL36-38 US3 EA IEA LA UL54 ADN CMV Réplication du cytomégalovirus. IEA : immediate early antigens (protéines très précoces), EA: early antigens (protéines précoces); LA : late antigens (antigène tardifs). Les protéines très précoces sont des protéines de régulation qui se localisent dans le noyau de la cellule infectée. La synthèse de l ’ADN polymérase UL54, protéine précoce, permet le début de la réplication de l ’ADN viral qui marque l ’entrée dans la phase tardive. La transcription des gènes très précoces ne requiert pas de synthèse protéique préalable. ADN répliqué Cycle de réplication

Cytomégalovirus Voies de transmission Multiples par contact direct Voie sexuelle (sperme et sécrétions cervico-vaginales infectés), respiratoire, contact avec excrétions virales (urines de nouveau-nés, salive...) Greffe d ’organe ou de moelle (cellules souches hématopoïétiques) Transfusion sanguine : PSL non déleucocytés (actuellement, les PSL sont systématiquement filtrés) Mère au fœtus ou au nouveau-né Virus fragile, sensible à la dessiccation, à la chaleur, il perd rapidement son pouvoir infectieux sur un support inerte. Sa transmission se fait en règle par contact direct entre individus.

INFECTION A CMV Réinfection Latence Primo- Virémie Organes cibles infection réplication Virus Greffon urine larmes sperme... Réinfection Latence Immunodépression Stimulation allogénique Réactivation Rôle de la réponse immunitaire : réponse humorale non spécifique : interférons qui constituent une réponse rapide contre les virus à ARN, mais une réponse moins efficace pour les virus à ADN. pp65 inhibe l’accumulation nucléaire de IRF-3 (interferon response factor 3) et donc inhibe l’activation de IRF-3, qui est un médiateur de la réponse interféron (J Virol, 2004, 78, 10995). Activation de la réponse interféron médiée par la voie NF-kB par exposition au virus ou aux glycoprotéines d’enveloppe spécifique : anticorps dirigés contre environ 15 protéines structurales et non structurales dont les phosphoprotéines du tégument UL32(pp150) Ul83 (pp65), protéine de capside UL86 (p150), IEA UL123 (p72), glycoprotéines d’enveloppe (UL55, UL75) La réponse humorale est insuffisante protéger contre l’infection mais peut la limiter :effet protecteur partiel (transmission mère-enfant, réinfection chez les receveurs de greffe) Réponse cellulaire non spécifique : NK, macrophage et les polynucléaires mais rôle dans la dissémination spécifique CD4 et CD8

Physiopathologie de l’infection à CMV Modifications du métabolisme cellulaire Tropisme Dissémination hématogène Latence et réactivation Transplantation Athérosclérose

Interaction de l’infection virale avec le métabolisme cellulaire Expression des molécules d’adhésion et de re-circulation Production des cytokines Régulation de facteurs de transcription Apoptose et cycle cellulaire

Tropisme cellulaire In vivo : très large chez l ’homme => cellules endothéliales => cellules épithéliales => cellules fibroblastiques => monocytes-macrophages In vitro : Cycle de réplication complet =>Cellules d ’origine humaine uniquement Fibroblastes embryonnaires +++ Autres types cellulaires Cycle de réplication abortif =>Certains types cellulaires d ’origine humaine ou animale

Récepteurs exprimés sur un grand nombre de cellules Tropisme cellulaire Récepteurs exprimés sur un grand nombre de cellules Cellules cibles in vivo monocytes/macrophages (latence, dissémination virale) endothéliales (dissémination virale) souches myélomonocytaires, stromales de MO (inhibition de la formation de colonies=> effet sur l’hématopoïèse) musculaires lisses (ulcérations TD, athérosclérose?) trophoblastiques (transmission materno-fœtale) épithéliales, fibroblastiques (poumon) glandulaires, gliales, neurones Réplication virale état de différenciation cellulaire

Dissémination hématogène Les leucocytes adhèrent à la surface de l’endothélium, vont à la jonction entre cellules endothéliales adjacentes et migrent à travers ces jonctions pour atteindre les tissus voisins. L’infection par le CMV des cellules endothéliales favorise l’adhésion des monocytes et leur migration à travers l’endothélium. Les cellules endothéliales infectées ont une expression accrue des molécules d’adhésion, leur perméabilité est accrue, l’expression des protéines de jonction est perturbée, le passage du virus de la cellule endothéliale vers le monocyte est facilité. Bentz et al, J Virol 2006

INFECTION A CMV : SITES DE LATENCE Types cellulaires Monocytes du sang circulant (0,01% des monocytes chez un individu naturellement infecté) => différenciation en macrophage => réplication Progéniteurs de la moelle osseuse CD34+ (monocytes CD33 CD14); (granulocytes CD33 CD15); (cellules dentritiques CD33 CD 15 CD1a) (Khaiboullina et al, BJH, 2004,126:410) réservoirs de virus persistance de l’infection Cellules endothéliales? (Reeves et al, J Gen Virol, 2004,85:3337) Cellules épithéliales et fibroblastes…? Tissus Nombreux : poumon, colon, rein, cerveau, foie …..

Comment s ’établit et se maintient l ’état de latence ? Echappement à la réponse immunitaire Mécanismes moléculaires de maintien du génome viral dans les cellules

ECHAPPEMENT A LA REPONSE IMMUNITAIRE HUMORALE n Diffusion par passage de cellule à cellule fusion cellulaire entre cellule infectée et cellule non infectée : connections cellulaires induites par l’infection virale (Digel et al, J Clin Virol, 2006, 37:10) n Liaison du virion à la bêta-2-microglobuline protection vis-à-vis des anticorps neutralisants? système alternatif d ’infection?

ECHAPPEMENT A LA REPONSE IMMUNITAIRE CELLULAIRE  Régulation négative de l'expression des molécules MHC de classe I et II à la surface des cellules infectées => Résistance à la lyse par les lymphocytes cytotoxiques CD8+ (classe I) => Obstacle à la présentation des épitopes viraux aux cellules T helper (classe II)  Immunosuppression transitoire par diminution de l ’activité des LCD4+ et augmentation des LCD8+  Expression restreinte dans les cellules non permissives  Inhibition de la présentation des antigènes très précoces  Séquestration des CC chimiokines (RANTES, MCP-1)

MAINTIEN DE LA LATENCE 1. Forme du génome: Absence d ’intégration de l ’ADN viral dans le chromosome Forme circulaire, épisomale démontrée dans les monocytes CD14+ du sang circulant de sujets en bonne santé (Bolovan-Fritts CA, Blood 1999, 93:394) les cellules NT2 en culture (Meier, J Virol, 2001,75:1581)

MAINTIEN DE LA LATENCE 2. ARN transcrits et protéines produites in vivo et in vitro : sens et antisens (région IE) dans les progéniteurs CD33+ in vitro : nombreux gènes exprimés dans les cellules CD34+ (résultat global) mais « pattern » différent de celui observé dans les cellules permissives ou lors d’une infection abortive Goodrun et al, PNAS, 2002, 99:16255 in vitro : récepteur de CC et CX3C chimiokines US28 dans les cellules THP-1 (lignée monocytaire)

MAINTIEN DE LA LATENCE 3. Déacétylation des histones in vitro : dans les cellules NT2 modification de l ’ADN viral (désacétylation des histones) différenciation => acétylation du MIEP et réactivation (transcription à partir du promoteur activateur très précoce majeur)

MAINTIEN DE LA LATENCE 4. Inhibition de la différenciation cellulaire Inhibition de la différenciation des monocytes en macrophages (interaction du virus avec les monocytes) Gredmark, J Virol, 2004, 78, 10378 Gredmark, J Immunol, 2004, 173,4897

REACTIVATION CHEZ LE SUJET IMMUNOCOMPETENT Episodes de réactivation prouvés par Mise en évidence d ’une excrétion virale intermittente dans l ’ urine, le sperme, les sécrétions cervicales Mise en évidence de virémie : exceptionnelle Oscillation du titre des anticorps Exemple : CMV détecté par culture et /ou PCR dans le sperme de 5 /175 donneurs (étude CECOS en France)

REACTIVATION ET IMMUNODEPRESSION Episodes de réactivation au cours du sida chez les receveurs d ’allogreffe au cours d ’hémopathies malignes au cours de traitements immunosuppresseurs : corticothérapie par ex (MICI) Echec de l ’hôte à éliminer les cellules infectées productrices de virus infectieux

REACTIVATION ET DIFFERENCIATION CELLULAIRE Modèles in vitro : cellules de tératocarcinome embryonnaire (NT2) différenciation induite par l ’acide rétinoïque en phénotype neuronal => expression des IE In vivo : différenciation Monocytes Macrophages

STIMULATION ALLOGENIQUE Transfusion de produits sanguins labiles contenant des leucocytes Réactivation du virus endogène (phénomène démontré dans un système expérimental chez la souris) Réactivation du virus du donneur Allogreffe de moelle ou d ’organe Réactivation du virus endogène (receveursd ’allogreffe de moelle) Réactivation du virus du donneur (receveurs de greffe de foie ou de rein) Rôle de l ’allostimulation dans un modèle murin (Hummel, J Virol, 2001, 75, 4814)

Réactivation Différenciation CMV ET TRANSFUSION Infection Allostimulation MONOCYTE latente Réactivation Différenciation active MACROPHAGE (CD1a, CD83), (CD14, CD64)

CMV et transplantation Greffe de moelle et pneumopathie interstitielle Processus immunopathologique ? Effet cytopathique direct ? Greffe d’organe et rejet Rejet favorisé Surexpression des protéines d’adhésion Cytokines inflammatoires Infection favorisée Immunosupression augmentée Stimulation allogénique

CMV et athérosclérose Types cellulaires potentiellement impliqués cellules endothéliales, musculaires lisses, macrophages, polynucléaires Inflammation Inhibition de l’apoptose des cellules musculaires lisses Mobilité des cellules musculaires lisses

Infection par le cytomégalovirus Conséquences cliniques Dépendent étroitement de l ’état immunitaire de l ’hôte Immunité normale : infection bénigne Immunodépression cellulaire (allogreffe, sida) : risque de maladies sévères à l ’occasion de la PI ou d ’une infection secondaire => diagnostic précoce => traitement spécifique Infection du fœtus et du nouveau-né après transmission in utero : risque d ’atteintes sévères et de séquelles neuro-sensorielles surtout si PI de la mère

Primo-infection par le cytomégalovirus Inapparente dans 90% des cas Inaperçue Symptomatologie banale et bénigne, pseudogrippale, non diagnostiquée Forme classique Syndrome mononucléosique Formes compliquées Formes sévères

Syndrome mononucléosique CMV Syndrome mononucléosique Fréquents Rares Symptômes Fièvre Dysphagie Myalgies Diarrhée Arthralgies Malaise Céphalées Toux Examen clinique Splénomégalie (30%) Rash Hépatomégalie Erythème pharyngé Adénopathies (25%)

Syndrome mononucléosique Complications Poumon Pneumopathie interstitielle Peau Eruption maculo papuleuse Foie Hépatite Système nerveux Syndrome de Guillain-Barré Méningoencéphalite Cœur Myocardite, péricardite Tube digestif Ulcérations Sang Anémie hémolytique Thrombopénie Œil Rétinite, uvéite, conjonctivite

Syndrome mononucléosique Formes sévères Cas exceptionnels 40 cas décrits dont 3 chez les femmes enceintes Evolution souvent mortelle Association de localisations hépatique, pulmonaire, encéphalitique =>Diagnostic rapide => Traitement spécifique

Infection à CMV Pouvoir immunosuppresseur du virus Anticorps de la réponse proliférative vis-à-vis d’Ag viraux ou bactériens, L CD8 + => inversion du rapport CD4+/CD8+ de l ’activité NK Anticorps Ac antinucléaires Facteur rhumatoïde Stimulation allogénique de la synthèse d’Ac dirigés contre d’autres antigènes

CMV Syndrome mononucléosique Biologie Hématologie Syndrome mononucléosique Délai d’apparition : souvent après 2 semaines d’évolution du syndrome clinique Lymphocytose entre 55 à 86% Lymphocytes atypiques : 12 à 55% des lymphocytes totaux Thrombopénie Biochimie Cytolyse hépatique (Elévation des transaminases)

Infection du receveur d ’allogreffe Modes d ’infection PI (transmission par le greffon) Réinfection (chez 86% des R de greffe de rein séro+) Réactivation (R de greffe de moelle séro+) => Etape clé : REACTIVATION de la souche du D ou du R Incidence : variable selon la greffe Délai de survenue de 1 à 4 mois après greffe en l ’absence de trt préventif Symptomatologie : PI : 2/3 des cas Réinfection : 40% des cas Réactivation : <20% des cas

Conséquences de l ’infection à CMV en transplantation d ’organe Stimulation allogénique Infection active Immunodépression Maladie à CMV signes généraux localisation Immunodépression Lymphomes EBV induits Inf opportunistes Dysfonction du greffon => rejet aigu => athérosclérose rejet => bronchiolite oblitérante chronique

Conséquences de l ’infection à CMV au cours du sida Stade avancé d ’immunodépression => <50-100 L CD4+/mm3 Localisations préférentielles œil => rétinite => cécité TD => ulcérations (colon +++, œsophage…) SNC neuropathies périphériques Myélites Encéphalites

Transmission mère-enfant Transmission in utero Très fréquente (1% des nouveau-nés infectés) A l ’occasion d ’une infection active (PI ou IS) Risque d ’infection sévère après PI maternelle en cours de grossesse (risque si ré-infection ? à considérer) Transmission périnatale Très fréquente (sources multiples de virus) Evolution habituellement favorable

Avt grossesse AC- AC+ Grossesse PI IS 35 à 50% <5% Infection fœtale Nouveau-né Symptomatique Asymptomatique 10% 30% 60% 5 à 15% 85 à 95% Dvpt Décès Séquelles Dvpt Normal Normal

Diagnostic de l ’infection à CMV Sérologie Anticorps de type IgG et IgM Avidité des anticorps de type IgG Diagnostic direct Recherche de la dissémination sanguine recherche d’une localisation viscérale

Méthodes de diagnostic direct Effet cytopathique in vivo exemple : cellules à inclusion, cellules endothéliales Culture sur fibroblastes embryonnaires humains « classique » => Isolement (ECP) rapide Mise en évidence des antigènes intracellulaires leucocytes du sang périphérique : antigénémie pp65 excrétion virale (LBA), tissus (immunocytochimie) Détection des acides nucléiques viraux ADN et ARN

Cellule endothéliale, infectée par le CMV, circulante

effet cytopathique sur cellules MRC-5 Isolement du virus effet cytopathique sur cellules MRC-5 (état frais) Coloration au Giemsa Inclusions cytoplasmiques et nucléaires

Culture rapide Inoculation à des FEH Centrifugation de l’inoculum sur les cellules => adsorption Incubation 24 à 48 h Fixation et coloration Révélation en immunopéroxydase ou immunofluorescence des IEA Avantages Rapidité, quantification relative, sensibilité Inconvénient pas de souche isolée

Détection d’antigène Antigénémie pp65 Antigènes de cellules diverses 2x105 leucocytes en spot (cytocentrification) IF révélant ag nucléaire pp65 Avantages : rapidité, simplicité, sensibilité, quantification Inconvénient : manipulation longue, lecture, délai entre prélèvement et manipulation < 3 h Antigènes de cellules diverses LBA, apposition sur lame de tissus… IF révélant IEA ou LA Avantages : rapidité, simplicité Inconvénient : sensibilité faible

Détection des acides nucléiques viraux ADN viral: Hybridation (peu utilisée) PCR simple ou nichée PCR en temps réel : en plein développement => détection qualitative ou quantitative seuil variable selon la technique (techniques « maison », trousses commercialisées) ARN messagers Technologie NASBA => trousses commercialisées

DISSEMINATION SANGUINE Monocytes ADN viral Polynucléaires Virus infectieux Antigène pp65 ADN viral Plasma ADN viral Couche leucocytaire Sang total Infection active

MARQUEURS SANGUINS DE L’INFECTION PCR à visée diagnostique Virus active Ag pp65 latente ARNm tardifs ADN génomique leucocytes plasma sang total PCR ultra sensible PCR à visée diagnostique

Syndrome mononucléosique à CMV Forme classique DIAGNOSTIC DIRECT Virémie Agpp65 ADNL (PCR) 1 mois 21% 50% 100% 2 mois 0 23,5% 81% 3 mois 0 0 40% 6 mois 0 0 16,6% > 6mois 0 0 0 Urines : excrétion peut être prolongée, intermittente Sperme

Localisations de la maladie à CMV Organe Prélèvement Technique Clinique Anapath Colon Biopsies Cult/PCR ++ +++ Foie Biopsie* Cult/PCR +++ Œil HA et/ou vitré * PCR ++++ - Poumon Biopsie * Cult/PCR ++ +++ LBA Cult/PCR - SNC Biopsie cérébrale* Cult/PCR ++ +++ LCR PCR - * exceptionnellement pratiqué

Rétinite à cytomégalovirus Aspect non hémorragique

Infection à CMV chez le receveur d ’allogreffe de moelle ou d ’organe Dépistage systématique de l ’infection active Prélèvements systématiques de sang =>antigénémie pp65, => PCR quantitiative (leucocytes, sang total, éventuellement plasma) Mise en route d ’un traitement anticipé (préemptif) Diagnostic et traitement de la maladie à CMV

Relation entre charge virale et risque de survenue de la maladie à CMV 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 3 4 5 6 7 charge virale Probabilité Cope AV, JMV 1997,52,200

Diagnostic de l ’infection à CMV au cours du sida Chercher une dissémination sanguine Rétinite diagnostic clinique Tube digestif clinique et aspect endoscopique biopsies digestives étagées : anapath et viro SNC PCR sur LCR

transmission mère-enfant Infection à CMV transmission mère-enfant Femme enceinte diagnostic d ’une infection active diagnostic de l ’infection primaire ou secondaire Fœtus prélèvement de liquide amniotique après 22 semaines d ’aménorrhée échographie Nouveau-né recherche de virus dans les urines (15 premiers jours de vie) prélèvements fonction de la symptomatologie

MOLECULES ANTIVIRALES GCV CDV PFA UL97 GCVp CDVp Kinases cellulaires GCVpp GCVppp CDVpp ADN polymérase virale

TRAITEMENT Traitement d ’attaque de 14 à 21 jours (GCV ou PFA) ou 2 perfusions (1/semaine) pour le CDV Traitement d ’entretien : => Maladie à CMV chez les patients immunodéprimés => Toxicité des molécules disponibles hématologique pour le GCV rénale pour PFA et CDV

Infection Post transfusionnelle : PREVENTION Infection Post transfusionnelle : => PSL filtrés systématiquement (+ donneur séro- pour les receveurs les plus à risque) Infection ou maladie chez les Receveurs de greffe => prophylaxie => traitement anticipé Transmission mère-enfant => conseils d ’hygiène aux femmes enceintes séronégatives Vaccination : Travaux en cours