Résistance du cytomégalovirus aux antiviraux après transplantation d’organe et greffe de moelle, à l’ère de la prophylaxie : Mise en place d’un Observatoire National en partenariat avec le Centre National de Réference du cytomégalovirus PHRC INTER-REGIONAL 2006

Investigateurs Investigateur principal : Co-Investigateurs : Dr ALAIN Sophie : Virologie, Centre National de Référence du Cytomégalovirus, Limoges Co-Investigateurs : Dr MENGELLE Catherine : Virologie, Toulouse Dr GARRIGUE Isabelle : Virologie, Bordeaux Dr MAZERON Marie-Christine : Virologie- Centre National de Référence du Cytomégalovirus, Paris Investigateurs cliniciens associés à _____ : A COMPLETER Attention :

Rationnel (1) La gravité de l’infection à CMV justifie des traitements préventifs et curatifs L’émergence de résistance est la résultante d’une exposition prolongée à un antiviral et de facteurs favorisant une persistance de la réplication virale : en particulier charge virale élevée, immunosuppression intense et sous dosage de l’antiviral au site de l’infection Une souche résistante peut donc émerger sous prophylaxie, ou après des traitements répétés L’incidence des résistances après traitement prophylactique par valganciclovir en pratique quotidienne reste à définir

Rationnel 2 En pratique, seule la résistance au ganciclovir a été étudiée sur de larges populations, et uniquement après transplantation d’organe (Lurain JID 2002). La fréquence des résistances dans ce contexte est de 9,5% chez les patients présentant une infection active à CMV (15,2% après transplantation pulmonaire) La résistance après prophylaxie est possible Sous valaciclovir (Alain et al., J Med Virol. , 2004) Sous ganciclovir oral (Boivin et al., JID 2004) Sous valganciclovir (Humar et al., 2005) Aucune donnée de cohorte n’est disponible après greffe de CSH

Emergence d’une souche résistante Avant traitement Traitement Après traitement Souche sauvage (Cycle viral normal) Souches mutantes Blocage du cycle viral des souches sensibles Prédominance de la souche résistante Prédominance de la souche sauvage Réplication virale => mutations+/-favorables Sélection

Les molécules antivirales disponibles inhibent l’ADN polymérase virale GCV-PPP CDV-PP PFA Foscarnet Ganciclovir GCV Cidofovir CDV GCV-PP GCV-P CDV-P Kinases cellulaires Ces molécules sont sans effet sur le virus latent elles sont virustatiques

Prodrogues : valaciclovir, valganciclovir ACV Val-ACV GCV Val-GCV UL97 ACV-PP ACV-PPP GCV-PP GCV-PPP De nouvelles molécules sont disponibles, le valaciclovir et le valganciclovir, utilisables en prévention de la maladie à CMV. Leur mécanisme d’action est le même qu ecelui du ganciclovir. Leur activation dépend de leur phosphorylation par la phosphotransférase virale UL97. ADN polymérase UL54

Association de résistances Ganciclovir Cidofovir Foscarnet 1 2 Mutation Mutation UL54 UL97 Modes de résistance du CMV aux antiviraux : 1ère ligne de résistance au GCV : UL97. Les mutations surviennent après une durée cumulée d’exposition de 3 mois en moyenne, 2ème ligne de résistance , UL54, après au moins six mois de traitement cumulé. Cidofovir et foscarnet : mutations de UL54 apparaissant après 6 à 9 mois de tt cumulé. Résistance au cidofovir Et Au ganciclovir Résistance isolée au ganciclovir Par défaut de phosphorylation Résistance au foscarnet Résistance croisée Association de résistances

Méthodes de détection des résistances Phénotype : Définit la concentration inhibitrice 50% et 90% de l ’antiviral testé Etudie le comportement du virus quel que soit l ’antiviral ou les mutations (nouveaux antiviraux) Inconvénients : Nécessite l ’isolement du virus en culture cellulaire Long et difficile à standardiser La mesure des concentrations inhibitrices de l’antiviral en culture cellulaire ou phénotype est la seule méthode qui permet d’étudier le comportement du virus vis à vis de n’importe quel antiviral. Cependant, cette méthode nécessite l’isolement du virus à partir des prélèvements du patient (sang, urine, LBA…). Les difficultés de standardisation et la variabilité des CI50 en fonction des isolats peuvent rendre son interprétation délicate. Cette méthode n’est pas disponible dans tous les laboratoires. Foyer de Cellules infectées

Méthodes de détection des résistances Génotype : Recherche les mutations de résistance dans un gène donné : UL97 ou UL54 Directement dans le prélèvement Plus sensible que le phénotype Permet la détection de mutations nouvelles Problèmes : Absence de banque de données sur les mutations de résistances Sensibilité variable des méthodes de génotypages : de 10% à 50% Méthode de séquençage standardisée développée par le CNR incluant Banque de mutations Sensibilité élevée (20%) Amplification par PCR RFLP Séquence Rapide non exhaustif Interprétation Du génotype

Emergence d ’une souche résistante in vivo Emery, J exp.Med., 1999; J. clin. Virol, 2001 Copies/ml Cinétique virale au cours d ’une infection à CMV non traitée: temps de doublement de la population 1 à 2 jours Décroissance virale sous traitement : 1/2 vie 1 à 2 jours Emergence du mutant : La souche mutée préexiste au traitement, devient dominante sous traitement puis redevient indétectable à l ’arrêt du traitement Décroissance de la charge virale en dessous du seuil de détection (200copies/ml de sang) en 21 jours sous traitement 200copies/ml 21j T Traitement Mutant Sauvage En compétition

La charge virale circulante permet-elle de prédire l’émergence de résistance après transplantation ? Sous traitement : Disparition de l’antigénémie en 10 à 15 jours Négativation de la PCR en 15-21 jours Valeur prédictive de la pente de décroissance ? Le temps nécessaire pour diminuer de moitié la quantité de CMV mesurée dans le sang est de 1,5 à 2 jours selon les patients. La décroissance est modifiée par l’apparition de souches résistantes au traitement. Emery et al., 2001

La décroissance virale sous traitement lors du premier épisode d’infection à CMV est prédictive des récurrences, en l’absence de résistance Humar et al., JID, 186, 2002 Exemples : Patients 1 et 2 : pas de récurrence ; Patients 3 et 4 : récurrences 52 patients prophylaxie par GCV oral ou IV 12sem Premier épisode de maladie à CMV (syndrome CMV et/ou atteinte d’un organe) : surveillance virologique rapprochée (hebdomadaire) Cependant récurrence n’est pas synonyme de résistance (Boivin 2001 : 1/12) TT GCV IV 10mg/kg/j 2 à 3 semaines

Quand craindre l’émergence d’une souche résistante? Devant une augmentation ou une persistance de la charge virale (PCR ou antigénémie) sous traitement à dose efficace chez un patient ayant été exposé de façon prolongée à un antiviral (prophylaxie ou traitements répétés) Ce d’autant que ce patient présente d’autres facteurs de risque de résistance La réponse retardée au traitement ne traduit pas systématiquement une résistance, mais représente un facteur de risque de récurrence, à surveiller. L’élévation de l’antigénémie dans les 2 premières semaines d’un traitement est possible. Elle n’est pas associée à une résistance. (Gerna et al., JID 2003; Nichols et al., Blood 2001)

Recherche des souches résistantes circulantes Résistance du CMV aux antiviraux après transplantation d ’organe (Lurain, JID, 2002) 2 cohortes de patients : Cleveland : 2345 patients suivis de 1990 à 2001 (Etude prospective) Chicago : 200 patients présentant une infection active à CMV (Etude rétrospective) Tous sous GCV en prophylaxie ou traitement Que sait-on aujourd’hui de la résistance aux antiviraux après greffe? Les Recherche des souches résistantes circulantes Phénotype et génotype

Cohorte de Chicago (Lurain, JID, 2002)

Cohorte de Cleveland (Lurain, JID, 2002)

Prophylaxies et résistance

Recueil rétrospectif par le CNR CMV des cas de résistance période 2004-2005 Résultats non exhaustifs (10 centres: n patients transplantés) 36 cas de résistance clinique signalés aux laboratoires de virologie 11 résistances avérées Identifiées par le génotype +/- phénotype Biais de recrutement des cas de résistance clinique (sur ou sous estimation) par absence de critères stricts Attention données non publiées. Merci

Nécessité d’une cohorte nationale L’émergence de souches résistantes est peu fréquente mais ses conséquences peuvent être graves s’il est impossible de lever l’immunosuppression Les modalités des traitements préventifs et immunosuppresseurs varient selon les équipes Les concentrations des traitements préventifs oraux sont parfois difficiles à maîtriser L’incidence des résistances après allogreffe de cellules souches hématopoiétiques est inconnue

Objectif principal Etude de l’incidence de la résistance du cytomégalovirus aux antiviraux après transplantation d’organe et greffe de cellules souches hématopoïétiques chez les patients présentant une infection active à CMV, dans la pratique quotidienne.

Bénéfice pour le patient et le clinicien Détection systématique des résistances devant toute persistance de la réplication virale au delà de 15 jours Résultat du génotype en temps réel Adaptation thérapeutique possible

Objectifs secondaires Mise en place, au niveau national, d’un réseau de recueil prospectif de données de souches et d’échantillons sous forme d’une cohorte documentée, non exclusive d’un autre protocole. (Utilisable ultérieurement pour l’étude de la résistance à de nouvelles molécules antivirales en développement) Etude génétique de la sélection des souches lors de l’épisode initial et au moment de la résistance clinique ou avérée Alimenter une banque de données permettant au CNR cytomégalovirus de générer des algorithmes de résistance : par mesure du poids des différentes mutations connues Et étude des mutations nouvelles identifiées en cours d’étude

Constitution de la cohorte Critère d’inclusion : première infection active à CMV Critère d’exclusion : patient non assuré social Patient refusant de participer L’inclusion dans la cohorte n’empêche pas la participation à un autre protocole Surveillance 18 mois ou plus Prélèvements : au premier épisode et à chaque suspicion de résistance

Prélèvements virologiques destinés à l’isolement de la souche virale et à la recherche de résistance  Trois tubes de 7ml de sang Deux tubes sur EDTA génotype dosage éventuel de la molécule administrée en cas de suspicion de résistance Un tube sur héparine Isolement viral. Un prélèvement d’urine en milieu de transport virus. Si disponibles, des prélèvements permettant d’identifier la souche présente au site de l’infection (lavage bronchoalvéolaire, biopsie, liquide céphalorachidien…).