F Martin-Laurent et D Bru PCR Quantitative F Martin-Laurent et D Bru UMR Microbiologie et Géochimie des Sols, INRA/Université de Bourgogne, 17 Rue Sully, BP 86510, 21065 DIJON CEDEX, Email fmartin@dijon.inra.fr et david.bru@dijon.inra.fr FML 13-12-04

Démonstration de PCR quantitative Principe de la PCR quantitative (F Martin-Laurent) Exemple d’applications de la PCR quantitative (F Martin-Laurent) Démonstration de l’utilisation du logiciel SDS (F Martin-Laurent) Démonstration de l’utilisation de l’ABI7900 (D Bru

Principe de la PCR conventionnelle Dénaturation du double brin d’ADN et hybridation des amorces Amorces, ADN, dNTPs, Taq Pol Elongation 72°C 55°C 95°C x 35 cycles Séparation électrophorétique FML 13-12-04

PCR conventionnelle versus PCR quantitative Analyse en point final sur gel d’agarose Phase plateau Analyse dynamique de la PCR quantitative haute précision pendant la phase exponentielle variabilité importante à la phase plateau Phase linéaire Phase exponentielle FML 13-12-04

PCR quantitative avec une sonde TaqMan® Cette méthode repose sur deux principes : -la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer) -l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol 5’ 3’ FP RP Reporter Quencher FAM, VIC TAMRA -Spécificité l’amorce pour la PCR -Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan FML 13-12-04

Essais 5’ nucléase avec la sonde TaqMan® Fluorescence 5’ 3’ FP RP R Q -FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie), pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte FML 13-12-04

Essais 5’ nucléase avec la sonde TaqMan® -au cours de l’élongation catalysée par la Taq Pol l’activité 5’ nucléase déplace la sonde 5’ 3’ FP RP R Q 5’ 3’ FP RP R Q -lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence. FML 13-12-04

FAM TAMRA Mécanisme de quenching nm nm Excitation -Le spectre d’emission du Reporteur recouvre le spectre d’absorption du Quencher nm Absorbtion Fluorescence 475 550 FAM FRET nm 550 600 Absorbtion Fluorescence TAMRA -FRET Émission FML 13-12-04

TaqMan® MGB probes NFQ non fluorescent quencher Nouvelle innovation MGB minor groove binder stabilise les 5 à 6 dernières bases de la sonde (à son extrémité 3’) sonde plus courte et plus spécifique (pour un Tm donné) FML 13-12-04

PCR quantitative SYBR ®Green Mesure de fluorescence en fin d’élongation FML 13-12-04

TaqMan ® versus SYBR ® Green Spécificité -fixation des amorces, -hybridation de la sonde, -conditions PCR -fixation des amorces, - -conditions PCR Flexibilité -multiplexe, -détection de SNP, - - -utilisation d’amorces dégénérées Optimisation -standardisée -dépend du gène ciblé -vérifier la formation de dimère d’amorces FML 13-12-04

ROX™ comme référence passive Le marqueur fluorescent ROX ™ permet de normalisé les variations de fluorescence non reliées à la PCR (fluorescence des plaques ou tubes, contamination du bloc PCR,…) ROX Echantillon 2 FAM Echantillon 1 Fluorescence Rn Rn= Reporter / Passive référence FML 13-12-04

Rn Ct cycle Détermination du Ct (cycle seuil) 10 2O 3O 4O 5O 1 2 3 4 Ct La valeur de Ct est déterminée dans la phase exponentielle, à l’intersection de la ligne de bruit de fond avec la courbe de fluorescence Bruit de fond Ligne de base FML 13-12-04

Courbe de calibration : comparer les valeurs de Ct Nombre de copies (log) Fluorescence émise (UA) Ct 106 105 104 103 102 101 Log N = -0,26 Ct + 10,85 R2= 0,998 Nombre de cycles Cycle seuil - Ct Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est fonction du nombre d’ADN cibles initialement présents FML 13-12-04

Quantification absolue Nombre de copies (log) Cycle seuil - Ct Log N = -0,26 Ct + 10,85 R2= 0,998 Nombre de cycles Fluorescence émise (UA) 101 106 105 104 103 102 Ct Résultat : l’échantillon d’ADN (ex: 25 ng) contient 10000 copies du gène cible FML 13-12-04

Efficacité de la PCR quantitative Log N = -0,26Ct + 10,85 R2= 0,998 Nombre de copies (log) Efficacité = 10(-pente) -1 atzA Cycle seuil - Ct Exemple pente = -0.26 E = 10(0.26) –1 = 1.82 – 1 = 0.82 soit 82 % Si la pente est égale à 0.301 alors l’efficacité de la PCR quantitative est de 100 % FML 13-12-04

cas spécifique E = 1 alors PCR efficace à 100% y = x (1 + E)n Quand E = 1 alors : Ct = + 1  augmentation x2 Ct= + 3.32  augmentation x10 cas spécifique E = 1 alors y = x 2n y=nombre de copie du gène cible x=nombre de copie initiale E=efficacité n=nombre de cycle PCR FML 13-12-04

Quantification relative pas besoin de courbe de standard calcul des résultats pas comparaisons des Ct nécessité de définir : un gène cible servant de contrôle endogène, un gène cible servant de standard. le contrôle endogène : - donne une image de la quantité de matrice apportée (ADN ou ADNc), - est présent en quantité constante dans tous les échantillons, - normalise : - les biais d’extraction et de contaminations par des inhibiteurs (ADN) - les variations d’éfficacité de transcription inverse FML 13-12-04

Standard -t0 ajout d’atrazine à des mésocosmes de sol, -t0 sera utilisé comme valeur standard FML 13-12-04

Comparaison du gène cible avec le contrôle endogène Ct=16 Ct=22 Cycle Rn Contrôle endogène Gène cible Ct = 22 – 16 = 6 Si 2 x plus de matrice ? Ct=16 Ct=22 Cycle Rn Ct=21 Ct=15 Contrôle endogène Gène cible Ct = 21 – 15 = 6 FML 13-12-04

Comparaison de Ct t0 t2 t4 t7 Contrôle endogène Gène cible Ct=16 Ct=32 Cycle Rn t0 Contrôle endogène Gène cible Ct=16 Ct=26 Cycle Rn t2 Ct=12 Ct=22 Cycle Rn t4 Ct=15 Ct=31 Cycle Rn t7 FML 13-12-04

2-Ct Comparaison de Ct Etape 1: normalisation par rapport au contrôle endogène Ct gène cible – Ct contrôle endogène = Ct Etape 2: normalisation par rapport au standard Ct échantillon - Ct standard = Ct Etape 3: détermination de la variation du nombre de copie du gène cible 2-Ct FML 13-12-04

Quantification relative des résultats 64 64 t4 Augmentation par x t7 1 1 standard FML 13-12-04

Quel échantillon d’ADN est le plus concentré et de combien de fois ? Exercice (1/4) Contrôle 16S rRNA Ct 14 atzA Ct 32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzA Ct29 Quel échantillon d’ADN est le plus concentré et de combien de fois ? 16S rRNA étant utilisé comme contrôle endogène…. FML 13-12-04

Ct 16SrRNA = 16 –14 = 2 2Ct 16SrRNA = 22 = 4 Exercice (2/4) Contrôle atzA Ct 32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzA Ct29 Ct 16SrRNA = 16 –14 = 2 2Ct 16SrRNA = 22 = 4 La concentration d’ADN de l’échantillon contrôle est 4 x plus élevée que celle de l’échantillon atrazine. FML 13-12-04

Exercice (3/4) Contrôle 16S rRNA Ct 14 atzA Ct 32 Atrazine Quel échantillon d’ADN contient le plus grand nombre de copie de la séquence atzA ? FML 13-12-04

Ct contrôle= 32 – 14 = 18 Ct atrazine= 29 – 16 = 13 Exercice (4/4) Contrôle 16S rRNA Ct 14 atzA Ct 32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzA Ct29 Ct contrôle= 32 – 14 = 18 Ct atrazine= 29 – 16 = 13 Ct = 18 – 13 = 5 2Ct = 25 = 32 Le nombre de copie du gène atzA est 32 fois plus élevé dans l’échantillon de sol traité avec l’atrazine que dans le contrôle FML 13-12-04

Analyse de la structure des communautés microbiennes Amplification PCR Amorces universelles : 38f et 72r IGS 5’ A 16 S 23 S 3’ RISA : Ribosomal Intergenic Spacer Analysis IGS 5’ B 16 S 23 S 3’ MM MM 12 14 15 16 17 18 20 21 22 25 26 44 45 46 47 48 49 50 MM MM kpb • Profils de bandes complexes • numérisation du gel et analyse statistique (présence/absence, intensité des bandes) 1.114 0.900 0.404 0.242 0.190 0.147 0.124 FML 13-12-04

Analyse des communautés microbiennes du sol de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule. LDSS LDCSS LDCSS- HAP SS100 SS10 FM U IA 900 692 501 484 404 320 L LP FP HP Couhins Pierrelaye La Bouzule U : contrôle LDSS : boue deshydratée LDCSS : boue deshydratée compostée LDCSS+HAP : boue deshydratée compostée amendée avec des HAP U : contrôle FM : fumier 10t/h/an SS10 : boue 10t/h/an SS100 : boue 100t/h/an LP : pollution faible FP : pollution moyenne HP : pollution élevée FML 13-12-04

Analyse des communautés microbiennes du sol de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule. -0.15 0.16 -0.16 U LDSS LDCSS LDCSS-HAP PC1 30% PC2 20% -0.2 0.16 -0.16 0.35 FM U SS10 SS100 PC2 15.2% PC1 45.3% Couhins -0.15 0.25 -0.25 0.15 HP FP LP PC1 30% PC2 21% Pierrelaye U : contrôle LDSS : boue deshydratée LDCSS : boue deshydratée compostée LDCSS+HAP : boue deshydratée compostée amendée avec des HAP U : contrôle FM : fumier 10t/h/an SS10 : boue 10t/h/an SS100 : boue 100t/h/an LP : pollution faible FP : pollution moyenne HP : pollution élevée FML 13-12-04

Cinétique de minéralisation de l ’atrazine des sols de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule. FML 13-12-04

Potentiel génétique de minéralisation de l ’atrazine des sols de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule. FML 13-12-04

PRINCIPE DE LA RT-qPCR Ct 1. Transcription inverse d’ARNm cibles en ADNc 1 ARNm = 1 ADNc 2. Quantification des ADNc par PCR quantitative en temps réel - qPCR Nombre de copies (log) Fluorescence émise (UA) Ct 106 105 104 103 102 101 Log N = -0,26 Ct + 10,85 R2= 0,998 Nombre de cycles Cycle seuil - Ct Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est fonction du nombre d’ADN cibles initialement présents FML 13-12-04

VOIE DE MINÉRALISATION DE L’ATRAZINE Acide cyanurique N-isopropylammélide N OH (CH3)2CH2HN atzB HO atzC N NHCH2CH3 (CH3)2CH2HN Cl atrazine OH N NHCH2CH3 (CH3)2CH2HN Hydroxyatrazine atzA atzD H2N NH2 O N H O Biuret atzE - H2N O O N H O Allophanate atzF CO2 + NH4+ FML 13-12-04

Niveau d’expression de l’ADNr 16S ARNr 16S / ng d’ARN extrait Temps (min) Temps (min) la quantité d’ARNr 16S est stable pendant l’expérience L’ARNr 16S = référence interne pour la mesure de l’expression des gènes atz au cours du temps FML 13-12-04

Niveau d’expression des gènes atzA, B et C P.ADP - ATRAZINE : Expression basale des gènes atz + ATRAZINE : Augmentation transitoire de l’expression des gènes atz Temps (min) ARNm /106ARNr 16S atzA atzB atzC C. heintzii - ATRAZINE : seul atzA s’exprime + ATRAZINE : Augmentation de l’expression des gènes atzA et B Pas d’expression d’atzC Temps (min) ARNm /106ARNr 16S atzA atzB atzC L’EXPRESSION DES GÈNES ATZ EST FONCTION DE LA SOUCHE BACTÉRIENNE CONSIDÉRÉE FML 13-12-04

Niveau d’expression des gènes atzD, E et F 500 1 000 1 500 2 000 100 200 300 400 Time (min) Relative number of mRNA b ab a atzF 50 150 250 350 atzE 20 40 60 80 120 140 160 Temps (min) x 150 En absence d’atrazine, atzD, E et F s’expriment de façon basale L’expression d’atzD et atzE augmentent 300 min après l’ajout d’atrazine x 20 L’expression d’atzF n’est pas affectée par l’ajout d’atrazine Augmentation de l’expression des gènes de l’opéron atzDEF selon un gradient FML 13-12-04