La génomique nouvel observatoire du monde microbien Jean Weissenbach (Genoscope – Centre national de séquençage) Université de tous les savoirs Saint-Pères 15 Juin 2008

Quelques dates de l'histoire de la microbiologie 1684 Antonie van Leeuwenhoek

Quelques dates de l'histoire de la microbiologie 1684 Antonie van Leeuwenhoek 1838 Schwann (levure ferment vivant) 1857 Pasteur (fermentation lactique) 1860 Pasteur (fermentation alcoolique) 1864 Pasteur (génération spontanée) 1881 Koch (cultures pures)

Postulats de Koch Par l'utilisation de cultures pures on peut montrer que des organismes distincts ont des propriétés biologiques différentes

Au cours des années 70 Carl Woese procède à des comparaisons systématiques de séquences d ’ARN des ribosomes de bactéries

TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCG b c d e f g TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCG TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCTTGAACGAGCGCAACCCCTG TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTG TGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTG TGTCGTGAGATGTTGGGGTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTA TGCCGTGAGGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTA TGCCGTGAGGTGTACCCTTAAGTGGGGAAACGAGCGTAACCCCTA f g a c b d e

Inventaire moléculaire de la diversité d‘espèces Extraction Echantillon de l'environnement Analyse de séquences séquençage sequences d‘ARNr 16S ADN Clonage dans E. coli Clones PCR gènes d‘ARNr 16S amplifiés

Inventaire moléculaire de la diversité d‘espèces Extraction Echantillon de l'environnement Extraction sequences d‘ARNr 16S Analyse de séquences séquençage ADN Clones PCR Clonage dans E. coli gènes d‘ARNr 16S amplifiés

Par cette approche Norman Pace observe dans les années 90 des séquences de rDNA qui ne correspondent pas à des espèces connues cultivées.

Les bactéries sont partout, nombreuses et vivent parfois dans des conditions particulièrement inhospitalières … Minimum Optimum Maximum Température élevée thermophile Pyrolobus fumarii 90°C 106°C 113°C basse psychrophile Polaromonas vacuolata 0°C 4°C 12°C pH acide acidophile Picrophilus oshimae 0,06 0,7 (60°C) 4 alcalin alcalinophile Natrialba magadii 8,5 9 12 pression barophile MT41 (Mariana Trench) 11033 mètres de profondeur 500 atm 700 atm 4°C > 1000 atm salinité halophile Halobacterium salinarum 15 % 25 % 32 % (saturation)

Avec l'augmentation de leur nombre, une compétition s'est instaurée pour les sources énergie matières premières (minérales ou organiques) Pour échapper à la compétition les bactéries ont recouru à l'innovation 1) en diversifiant leurs sources d'énergie et de matières premières 2) en s'adaptant à des environnements particuliers

énergie oxydoréductions chimiques différents oxydants, différents réducteurs lumière plusieurs utilisations de la lumière avec ou sans production d'O2 matières premières (minérales ou organiques) C minéral (CO2 ou organique) N atmosphérique ou sels conditions du milieu température pH ions

Streptococcus pneumoniae Chondromyces Streptococcus pyogenes Salmonella Vibrio cholerae Pseudomonas Vue en m.e coloration négative vue en m. e à balayage

Plus de 99% des bactéries sont encore inconnues de nos jours Habitat Nombre de bactéries % de bactéries cultivables Sol 1010 - 1013 / kg 0,01 - 0,1 Rivières, lacs 109 - 1010 / l Océans (surface) 107 - 109 / l 0,001 - 0,1 Océans (profondeur) 107 - 108 / l indéterminé Océans (sédiments) 109 - 1012 / l < 1 %

Les bactéries sont partout et nombreuses ... Sols   107 à 1010 bactéries / g Eaux potable en général maximum 1000 bactéries / mL bassin de natation 100 bactéries / mL mer peu polluée 10.000 bactéries / mL Aliments lait stérilisé maximum 100 bactéries / mL viande hachée 106 bactéries / g Corps humain sain et propre peau du dos 100 à 1000 bactéries / cm2 peau des aisselles ou du pubis 106 bactéries / cm2 fèces 50 % de la masse soit 1011 bactéries / g

La flore intestinale humaine Cent mille milliards de bactéries !!! Chacun de nous héberge cent mille milliards de bactéries constituant la flore digestive. Stérile avant la naissance, notre tube digestif est rapidement colonisé par cette flore complexe et diversifiée qui se stabilise au cours des premières années de la vie. Les interactions entre l’organisme et la flore digestive participent au maintien en bonne santé, alors que nous associons souvent "bactéries" et "maladie". Les bactéries que nous hébergeons ont un rôle bénéfique en termes de nutrition et de santé.

la biomasse microbienne représente Au niveau de la planète la biomasse microbienne représente plus de la moitié de la biomasse terrestre

Croûte terrestre 100 10 1 0,1 Si O Ca Na Mg H P S C N 0,01 0,1 1 10 100 Biomasse

D'où vient le carbone ? Carbone minéral : CO2 (bactéries autotrophes : chimiolithotrophes, phototrophes) Carbone organique (bactéries hétérotrophes)

Croûte terrestre 100 10 1 0,1 Si O Ca Na Mg H P S C N 0,01 0,1 1 10 100 Biomasse

D'où vient l'azote ? Azote atmosphérique N2 Composés minéraux de l'azote (NH4+, NO2-, NO3-)

Le rôle de l'infiniment petit dans la nature est infiniment grand Louis Pasteur

A ce jour Nos connaissances en microbiologie ont été obtenues à partir de quelques centaines d’espèces parmi les quelques 5000 espèces répertoriées Moins de 1% des bactéries sont cultivées Le monde microbien reste encore pratiquement inexploré La plupart des contributions du monde microbien à la vie de la biosphère ne sont connues que superficiellement

De nombreuses raisons de s'intéresser aux communautés bactériennes impact sur les équilibres biogéochimiques quels sont les acteurs ? nouvelles étapes des cycles biologiques des éléments impact sur la santé (flores microbiennes humaines) modèles d'écosystèmes (structure des communautés bactériennes) utilisation de la biodiversité à des fins d'applications substances thérapeutiques substances d'intérêt industriel enzymes utiles pour la chimie de synthèse bioremédiation nouveaux éclairages sur l'évolution

Comment aborder la question de la composition des communautés bactériennes ? rDNA 16S FISH métagénomique techniques sur cellules isolées culture

Echantillon de l'environnement La métagénomique Extraction Echantillon de l'environnement Extraction sequences d‘ADN Clones séquençage Analyse de séquences Clonage dans E. coli ADN

Tous les génomes de bactéries possèdent au moins une copie du gène rouge

Ce gène rouge présent chez toutes les bactéries est en fait composé - de parties communes retrouvées dans ce gène dans toutes les bactéries - de parties qui sont propres à une seule espèce de bactéries

Ce gène présent chez toutes les bactéries possède des parties communes (noir) qui sont présentes sur la séquence de ce gène dans toutes les bactéries ceci permet de le retrouver à partir d'un mélange des ADN extraits de bactéries vivant dans un environnement particulier

Ce gène présent chez toutes les bactéries possède des parties (autres couleurs) qui sont uniques à chaque espèce de bactéries ceci permet de distinguer ce gène chez une espèce du même gène chez les autres espèces du mélange

Ce gène présent chez toutes les bactéries possède des parties (autres couleurs) qui sont uniques à chaque espèce de bactéries ceci permet aussi savoir quelles espèces connues et inconnues sont dans le mélange et d'avoir une idée du nombre d’espèces de bactéries qui sont dans le mélange et de leur abondance

Résultats : Hybridation in situ sur les boues Floc du bassin aérobie (BA) photo CLSM (gross. 630) hybridation avec sonde : - groupe Planctomycetales Pla46F marqué au CY5 - sonde spécifique « nouveau genre » 322R marqué au CY3 - superposition Pla46F et 322R - autofluorescence 10 µm 10 µm

des données d'un métagenome Problèmes d'analyses des données d'un métagenome Données très fragmentaires Liens perdus avec les cellules d'origine La grande majorité de ces cellules sont inconnues

Quelques résultats de la métagénomique reconstitution de la séquence génomique complète de plusieurs bactéries non cultivables présence d'un grand nombre de gènes de proteorhodopsine dans les bactéries découverte de dizaines de milliers de gènes de fonction inconnue association entre type de flore bactérienne intestinale et obésité