Outils chimiques pour l’étude des macromolécules biologiques Marius Réglier Laboratoire de Bioinorganique Structurale, service 432 Chimie, Biologie et Radicaux Libres UMR-CNRS 6517 Université Paul Cézanne Aix-Marseille III Faculté des Sciences et techniques Avenue Escadrille Normandie-Niemen 13397 Marseille cedex 20 http://www.lbs.fst.u-3mrs.fr Marius.reglier@univ.u-3mrs.fr

I. L’apport de la chimie à la biologie moléculaire

Le 25 avril 1953, Crick et Watson révèlent la structure de l'ADN Erwin Chargaff Rosalind Franklin Prix Nobel de Medecine en 1962 F. Crick, J. Watson et M. Wilkins

Le dogme transcription tRNA traduction DNA mRNA protéine réplication

L’ADN, deux paires de bases AT, CG

Triplex

Quadruplex Télomères

ADN, deux brins 3’ 5’ T C G A

DNA, double hélice

DNA, polymorphisme Forme B, forme commune dans les conditions physiologiques, faible force ionique et haut dégré d’hydratation (10 paires de bases/tour avec une conformation C2'-endo/anti), deux sillons distincs. Forme Z, (Zigzag) riche en paires G-C, allongée et étroite, possède une unusuelle hélice gauche (12 paires de bases/tour), un seul sillon compact Le Zigzag résulte d’une alternance de purines (C3'-endo/syn) et de pyrimidines (C2'-endo/anti). Forme A-form, aux fortes concentrations en cations ou aux faibles degrés d’hydratation (11 paires de bases/tour, C3'-endo/anti), 2 sillons (1 grand étroit et profond et 1 petit large et peu profond).

DNA, polymorphisme

DNA, packaging nucléosomes Chromosome chromatine

Réplication

Transcription et traduction

ARN, deux paires de bases AU, CG ADN ARN

ARN, monobrin 3’ 5’ U C G A

ARNt

Anti-codon

Le code universel 43 (64) codons pour 20 amino-acides TTT  F Phe      TCT  S Ser      TAT  Y Tyr      TGT  C Cys TTC  F Phe      TCC  S Ser      TAC  Y Tyr      TGC  C Cys TTA  L Leu      TCA  S Ser      TAA  * Ter      TGA  * Ter TTG  L Leu i    TCG  S Ser      TAG  * Ter      TGG  W Trp CTT  L Leu      CCT  P Pro      CAT  H His      CGT  R Arg CTC  L Leu      CCC  P Pro      CAC  H His      CGC  R Arg CTA  L Leu      CCA  P Pro      CAA  Q Gln      CGA  R Arg CTG  L Leu i    CCG  P Pro      CAG  Q Gln      CGG  R Arg ATT  I Ile      ACT  T Thr      AAT  N Asn      AGT  S Ser ATC  I Ile      ACC  T Thr      AAC  N Asn      AGC  S Ser ATA  I Ile      ACA  T Thr      AAA  K Lys      AGA  R Arg ATG  M Met i   ACG  T Thr      AAG  K Lys      AGG  R Arg GTT  V Val      GCT  A Ala      GAT  D Asp      GGT  G Gly GTC  V Val      GCC  A Ala      GAC  D Asp      GGC  G Gly GTA  V Val      GCA  A Ala      GAA  E Glu      GGA  G Gly GTG  V Val      GCG  A Ala      GAG  E Glu      GGG  G Gly

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) 5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ 5’--ACGTAA---3’ + 5’---AACGTC--3’ + dNTP + TaqPol  --ACGTAA---5’ 5’---AACGTC-- 3’--ACGTAA---5’ + 5’---AACGTC--3’ dNTP + TaqPol

Polymerase Chain Reaction (PCR) 5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’  5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ + 3’--ACGTAA---5’ + 5’---AACGTC--3’ 5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ --ACGTAA---5’ 5’---AACGTC-- 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ + dNTP + TaqPol 5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ + 30 cycles permettent d’amplifier 2 brins d’ADN en 34359738368 exemplaires.

Plasmide

Enzyme de restriction (EcoRI) CAATTG

I.1. Synthèse des oligonucléotides

Synthèse des oligonucléotides en phase supportée la synthèse chimique des oligonucléotides se fait de 3' vers 5'.

Les dérivés phosphoramidites des 4 nucléotides

Etape 1: de-blocking

Etape 2: Condensation

Etape 3: Capping

Capping -----ATGCTACGTCAACTA----- Sans -----ATGCTAC -----ATGCTA -----ATGCTACG -----ATGCTAG -----ATGCTAC -----ATGCTACGT -----ATGCTAGT -----ATGCTACT -----ATGCTAG Avec -----ATGCTACGTCAACTA----- -----ATGCTACGTCAACT -----ATGCTACGTCAAC -----ATGCTACGTCAA -----ATGCTACGTCA -----ATGCTACGTC -----ATGCTACGT -----ATGCTACG

Etape 4: Oxydation

Etape finale

Synthétiseur

I.2. Séquençage de l’ADN

La méthode de Maxam and Gilbert 5’-----------------ATGCTACGTCAACTA-----------------3’ 3’-----------------TACGATGCAGTTGAT-----------------5’ Enzyme de restriction (EcoRI) Introduction dans un plasmide 5’-----ATGCTACGTCAACTA-----3’ 3’-----TACGATGCAGTTGAT-----5’ Primer ADN polymérase dATP, dTTP, dCTP et dGTP  dATP radioactif P32

La méthode de Maxam and Gilbert 5’-----ATGCTACGTCAACTA-----3’ Tube 2 + Me2SO4-0.1M HCl 3’---TACGATGCAGTTG 3’---TACGATGCAGTT 3’---TACGATGCA 3’---TACGATGC 3’---TACGAT 3’---TACG 3’---TAC 3’---T A + G Tube 1 + Me2SO4-0.1M NaOH G Tube 3 + N2H4 3’---TACGATGCAGTTGA 3’---TACGATGCAGT 3’---TACGATGCAG 3’---TACGATG 3’---TACGA 3’---TA 3’--- C + T Tube 4+ N2H4-NaCl C

La méthode de Maxam and Gilbert A+G T+C C A AT ATG ATGC ATGCT Migration ATGCTA Lecture ATGCTAC ATGCTACG ATGCTACGT ATGCTACGTC ATGCTACGTCA ATGCTACGTCAA ATGCTACGTCAAC ATGCTACGTCAACT ATGCTACGTCAACTA

Séquençage de l’ADN : la méthode de Sanger

Séquençage de l’ADN : la méthode de Sanger Primer ADN polymérase dATP, dTTP, dCTP et dGTP  dATP radioactif P32 5’-----ATGCTACGTCAACTA-----3’ 3’-----TACGATGCAGTTGAT-----5’ Tube 1 + ddTTP -----ATGCTACGTCAACTA----- -----TACCATGCAGTTGAT -----TACCATGCAGTT -----TACCATGCAGT -----TACCAT -----T Tube 2 + ddCTP -----ATGCTACGTCAACTA----- -----TACCATGC -----TACC -----TAC Tube 4+ ddATP -----ATGCTACGTCAACTA----- -----TACCATGCAGTTGA -----TACCATGCA -----TACCA -----TA Tube 3 + ddGTP -----ATGCTACGTCAACTA----- -----TACCATGCAGTTG -----TACCATGCAG -----TACCATG

Autoradiographie du gel de séquence ddGTP ddATP ddTTP ddCTP A C G T A AT ATG ATGC ATGCT Migration ATGCTA Lecture ATGCTAC ATGCTACG ATGCTACGT ATGCTACGTC ATGCTACGTCA ATGCTACGTCAA ATGCTACGTCAAC ATGCTACGTCAACT ATGCTACGTCAACTA

Fluorescence (Diagramme de Jablonski ) Energie S1 hn hn S0 FAM max = 490-495 nm Emmax = 515-520 nm

Pigments

Marquage fluorescent Dye-labeled primer sequencing colorant attaché en 5’ du primer 2) Internal labeling colorant attaché à un dNTP et incorporé durant la synthèse du nouveau brin d’ADN 3) dye-labeling terminator sequencing colorants attaché à un ddNTP

Point d’ancrage du pigment

Dye-labeled primer sequencing 5’-----ATGCTACGTCAACTA-----3’ 3’-----TACGATGCAGTTGAT-----5’ Primer ADN polymérase dATP, dTTP, dCTP et dGTP Tube 1 + ddTTP -----ATGCTACGTCAACTA----- ----TACCATGCAGTTGAT ----TACCATGCAGTT ----TACCATGCAGT ----TACCAT ----T Tube 2 + ddCTP -----ATGCTACGTCAACTA----- ----TACCATGC ----TACC ----TAC Tube 4+ ddATP -----ATGCTACGTCAACTA----- ----TACCATGCAGTTGA ----TACCATGCA ----TACCA ----TA Tube 3 + ddGTP -----ATGCTACGTCAACTA----- ----TACCATGCAGTTG ----TACCATGCAG ----TACCATG

d-Rhodamine dye-labeled terminators ddC-EO-5dTMR ddT-EO-6dROX

d-Rhodamine dye-labeled terminators ddT-PA-5dR6G ddT-EO-5dR110 PA, propargylamino - EO, propargyl ethoxyamino

ddT-BigDye terminator excitation émission Transfert d’énergie

Gel de séquence