Diagnostic des infections à gonocoque par techniques moléculaires Diagnostic des infections à gonocoque et à Chlamydia trachomatis par techniques moléculaires H. Hochard, C. Delamare CHR Metz Thionville mardi 11 septembre 2012 H. Hochard, C. Delamare CHR Metz-Thionville

EPIDEMIOLOGIE

Neisseria gonorrhoeae (NG) Plus de déclaration obligatoire depuis 2000 pas de données de prévalence Estimation de l’incidence grâce aux réseaux : RENAGO de laboratoires, dont les patients consultent majoritairement en médecine de ville RésIST de cliniciens, dont les patients consultent quasi-exclusivement dans des structures spécialisées (CIDDIST et CDAG) Rénago : réseau national des gonocoques 2009 : 5,5 gono/labo (homme) 0,78 gono/labo (femme) ResIST : cliniciens des CIDDIST Renago, 2008

Réseaux de surveillance augmentation des infections gonococciques population homosexuelle masculine, mais aussi hétérosexuelle masculine et féminine médiane âge femmes infectées 24 ans vs 27 ans pour les hommes portage asymptomatique (plus fréquent +++ chez la femme : 50-90 % vs < 1 % chez l’homme), favorise la transmission augmentation des résistances

Évolution du nombre moyen de gonocoques isolés par laboratoire actif et par an selon le sexe (réseau Rénago) Augmentation de la fréquence de l’infection chez l’homme (+26%) comme chez la femme (+33%) entre 2008 et 2009

Évolution du nombre moyen de gonococcies par site participant et par an selon le sexe (réseau RésIST)

Recommandations de dépistage Absence de recommandations de dépistage en France Recommandations européennes (IUSTI - OMS, 2001, actualisées 2008) En présence de symptômes En l’absence de symptômes symptômes ou signes d’écoulements urétraux chez l’homme jeune adulte dépisté pour une IST orchi-épididymite chez l’homme de moins de 40 ans partenaire sexuel d’une personne ayant une IST ou une atteinte inflammatoire pelvienne écoulement vaginal avec facteurs de risque d’IST nouveaux ou multiples partenaires cervicite mucopurulente inflammation pelvienne aiguë - IUSTI = International Union against Sexually Transmitted Infections - facteurs de risque IST : âge < 30 ans, nouveau partenaire sexuel FDR : ≥ 3 p/6 mois, atcd IST, AES, p avec FDR 7

Chlamydia trachomatis (CT) 1er agent bactérien responsable d’IST dans les pays industrialisés Réseau de surveillance : RENACHLA (laboratoires) incidence ≈ 4 % infections asymptomatiques chez 75 % des femmes et 50 % des hommes prévalence varie en fonction : des populations étudiées (lieu de recrutement) de l’âge : maximale chez les femmes de 18 à 24 ans et chez les hommes de 25 à 30 ans

Chlamydia trachomatis (CT) Réseau Rénachla HOMMES Augmentation du nombre de diagnostics de 19 % chez l’homme entre 2008 et 2009

Augmentation du nombre de diagnostics de 25 % chez la femme Réseau Rénachla FEMMES Augmentation du nombre de diagnostics de 25 % chez la femme entre 2008 et 2009

Sex Transm Infect. 2010 Aug;86(4):263-70. Estimation de la prévalence en France des infections à CT dans la population générale 2 580 personnes testées 18 - 44 ans Auto-prélèvement vaginal (femmes) ou urine (hommes) : à domicile 18 - 44 ans : Hommes = 1,4% Femmes = 1,6% 18 - 29 ans : Hommes = 2,5% Femmes = 3,2% Prevalence of Chlamydia trachomatis: results from the first national population-based survey in France. Goulet V, de Barbeyrac B, Raherison S, Prudhomme M, Semaille C, Warszawsk J; CSF group. Sex Transm Infect. 2010 Aug;86(4):263-70.

Recommandations de dépistage HAS 2003 personne symptomatique CIDDIST, CDAG : dépistage systématique chez les femmes de 15 à 25 ans et les hommes < 30 ans quels que soient l’âge et le sexe si >1 partenaire dans l’année un ou une partenaire infecté(e) à C.trachomatis + bilan hypofertilité +suivi efficacité thérapeutique 12

DIAGNOSTIC

Neisseria gonorrhoeae Diagnostic direct détection de Neisseria gonorrhoeae dans les différents milieux accessibles à un prélèvement (urètre, endocol, urines…) par culture détection du génome bactérien par biologie moléculaire Diagnostic indirect : sérologique, qui met en évidence les anticorps inapproprié dans le cadre d’un dépistage et d’un diagnostic sérologie = peu sensible intérêt = dans arthrite post-gonococcique

Chlamydia trachomatis Détection du génome bactérien par biologie moléculaire avec amplification génique Sensibilité > 95% Spécificité > 99% Adaptée dans toute situation clinique et pour tout type de prélèvement Les techniques de détection directe de CT par identification des inclusions intracellulaires sur culture ne sont plus recommandées. Il est préconisé de ne plus utiliser la technique de détection directe par méthode immunologique. Aucun intérêt de la sérologie dans les infections basses - bio moléculaire sans amplification : moins performante (ANAES 2003) (SE=85% endocol, 65% urètre, non étudiée urines) - sérologie = valeur limitée, indicative dans les suspicions d’infection haute et bilan hypofertilité ; pneumopathie nourrisson DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE L’INFECTION Á CHLAMYDIA TRACHOMATIS HAS Juillet 2010

Les prélèvements Culture (NG) Tests moléculaires endocol urètre écoulement urétral anal pharyngé Tests moléculaires endocol vagin (auto-prélèvement) urètre sperme urine anal pharyngé

Les milieux de transport Culture (NG) milieu de transport gélosé ! inhibition PCR Tests moléculaires (1 seul écouvillon pour NG et CT ) matériel de prélèvement avec milieux de transport spécifiques aux différents tests de diagnostic moléculaire non interchangeables important d’adresser au laboratoire le milieu en adéquation avec la technique de diagnostic à titre d’exemple : milieu Abbott contient du thiocyanate de guanidium qui inhibe la PCR Cobas Roche, car la libération des acides nucléiques associée a cette technique est une lyse et non une extraction  n’élimine pas le thiocyanate milieu de transport pour culture : actuellement = gélosé TGV de biorad (transport de germes vivants) liquide de biomérieux

NG : La microscopie (coloration de Gram) réalisée en systématique pour toute demande de culture visualisation directe du gonocoque sous la forme de diplocoques à Gram négatif intracellulaires « en grain de café » sensibilité : élevée en cas d’urétrite aiguë chez l’homme (sensibilité > 95 %) mauvaise chez les hommes asymptomatiques (50 à 75 %) et chez la femme à partir des prélèvements endocervicaux et urétraux (respectivement 45 à 65 % et 20 %) non adaptée aux localisations anorectales et pharyngées présence de cocci à Gram négatif appartenant à d’autres espèces bactériennes sensibilité ≤ 40 % conclusion : intérêt pour diagno présomptif rapide chez homme en cas d’urétrite aiguë purulente NB : > 95 % = sur écoulement urétral

NG : La culture Patients symptomatiques : méthode de référence {IUSTI/WHO 2008} Milieu de culture (gélose chocolat) sélectif contenant des antibiotiques (VCN) // Milieu non sélectif Avantages : faible coût sensibilité :  90% (80 à 96 % selon les études) pour les prélèvements d’urètre, ≈ 80-90 % pour les prélèvements cervicaux permet la réalisation d’un antibiogramme et d’un typage pour les études épidémiologiques Inconvénients : nécessité d’effectuer des prélèvements invasifs transport rapide vers le laboratoire délai d’obtention des résultats de 2 à 3 jours sensibilité faible pour pharynx et anus (respectivement < 50 % et < 60 %) - 18-24h : colonies grisâtres à bord réguliers - milieu sélectif Neisseria pathogènes (gono + méningo) : gélose chocolat enrichie de suppléments vitaminiques et additionnée d’antibiotiques sélectifs = VCN (vancomycine - colistine - nystatine) Une certaine proportion des souches est cependant sensible à la vancomycine, d'où l'utilité d'ensemencer aussi sur milieu non inhibiteur en parallèle. - incubation sous 5-10% CO2 - spécificité proche de 100 % pour urètre et endocol

Les tests de biologie moléculaire Détection des acides nucléiques du génome bactérien (ADN ou ARN) Différentes techniques : ( hybridation moléculaire ) techniques d’amplification génique PCR TMA SDA

PCR ( Polymerase chain reaction ) Amplification cyclique d’un segment d’ADN cible 3 températures : 95°C : dénaturation de l’ADN entre 50 et 65°C : hybridation des amorces oligonucléotidiques complémentaires à leurs régions cibles 70°C : élongation dans le sens 5’→ 3’ des amorces par Taq polymérase  40 cycles : 106 fois la cible PCR temps réel : Détection (et quantification) d’un signal fluorescent émis par un fluorophore dont l’intensité d’émission est directement proportionnelle à la quantité de produits amplifiés. 40 cycles = 106 copies seulement (au lieu de 1099 milliards) car en pratique les conditions expérimentales évoluent au fur et à mesure de l’avancée des cycles, et le rendement de la réaction de polymérisation évolue de même.

SDA ( Strand Displacement Amplification ou amplification par déplacement de brin ) Amplification isothermique d’ADN 2 enzymes thermorésistantes : une enzyme de restriction une ADN polymérase 2 couples d'amorces ADN cible possédant ce site de restriction est généré à l'aide de la polymérase

TMA (Transcription Mediated Amplification) Amplification isothermique d’ARN (via un intermédiaire ADN) 2 enzymes : ARN polymérase transcriptase inverse (+ RNAse) synthèse d’un ADN double brin transcriptible en ARN par la transcriptase inverse amplification par l’ARN polymérase : transcription d’une série d’ARNs (50 à 100 copies) Les ARNs synthétisés servent à leur tour de matrice pour la synthèse d’un ADNdb.

Sonde d’hybridation Hybridation directe à l’aide de sondes ADN Gen-Probe PACE 2® (sonde ADN qui s’hybride à l’ARN ribosomal du gonocoque) peu utilisée en France pour NG : moins sensible et moins spécifique que la culture pas utilisée pour CT - L’hybridation provoque une réponse chemiluminescente qui peut être détectée au luminomètre. - parfois utilisée pour confirmer les résultats de tests effectués avec d’autres techniques - Digene Hybrid Capture® (sonde ARN qui s’hybride à l’ADN du gonocoque)

Roche Cobas Amplicor CT/NG® Abbott RealTime CT/NG® BD ProbeTec Gen-Probe Aptima Combo 2 CT/NG® Automatisation oui Technique d’amplification PCR SDA TMA Système de détection colorimétrie fluorescence chemiluminescence Prélèvements acceptés Urine Urétral Endo-cervical Vaginal Région cible gono (gène) : Roche = Méthyl-transférase Abbott = opa BD = Recombinase piv Gen-Probe = ARN16s

Sensibilité des techniques Les notices des kits montrent que ces tests ont une sensibilité et une spécificité élevées. NG : sensibilité = 96,0 à 97,8 % spécificité = 98,1 à 98,9 % CT : sensibilité = 88,9 à 95,9 % spécificité = 96,6 à 98,9 %

Performance des tests moléculaires Sensibilité et spécificité élevées varient en fonction de la technique d'amplification utilisée et du site de prélèvement Sensibilité sur les prélèvements cervicaux > urine (Sensibilité sur les prélèvements urétraux légèrement > urine) Chez les individus asymptomatiques : performance des tests moléculaires supérieure à celle de la culture (NG) Ces conclusions étaient limitées par la faiblesse méthodologique des études, les caractéristiques de la population étudiée et les différentes techniques de détection évaluées. L’hétérogénéité des études et leurs limites méthodologiques ne permettaient pas la comparaison des différentes techniques moléculaires en fonction des sites de prélèvement et du statut sympto/asympto de la population étudiée. (pas de preuves suffisantes pour positionner les techniques en fonction…) Autre étude (hôpital Saint-Louis) = Abbott realtime PCR  bonnes sensibilité et spécificité sur urines, en particulier chez femmes asympto

NG : Nécessité de confirmer les résultats du test initial par une autre technique d’amplification ? Existence de résultats faux-positifs, quelle que soit la technique d’amplification  Contrôle des positifs par une autre technique, ciblant une séquence différente du génome CHR Metz-Thionville, laboratoire de Metz : collaboration avec Dr Patricia Franck Responsable Filière Biologie médicale Maternité régionale universitaire de Nancy faux positifs par réactions croisées : certaines souches de Neisseria non pathogènes de la flore buccale peuvent donner faux positifs

Avantages des techniques moléculaires détection possible dans des prélèvements inadaptés à la culture (urine, prélèvements vaginaux) ne requièrent pas la viabilité des bactéries milieux de transport stables plusieurs jours délai de rendu des résultats plus court automatisation  adaptation aux grandes séries

Mise en place de la méthode Abbott RealTime CT/NG® au laboratoire de Metz

Etude réalisée en 2010 (6 mois) 1085 prélèvements : 36 reçus (31 patients) pour recherche spécifique de Neisseria gonorrhoeae 1049 reçus pour recherche de Chlamydia trachomatis Origine des prélèvements : déjà PCR CT depuis 2 ans puis proposition tester multiplex  évaluation gono dont 12% vagin 31

Résultats Recherche spécifique de Neisseria gonorrhoeae : 31 patients CIDDIST (9 femmes et 22 hommes) Age médian : 25 ans Symptomatiques : 3 femmes (33%) et 10 hommes (45%) Positifs NG : 3 patients (1 femme, 2 hommes) = 9.7% 32

Résultats Recherche systématique de Neisseria gonorrhoeae : 1049 patients 322 CIDDIST - Age médian : 22 ans - Symptomatiques : 11 (3,4%) - Facteurs de risque : 159 (49%) - Positifs NG : 0 727 Gynécologie-Obstétrique - 164 grossesses asymptomatiques Positifs NG : 2 (0,19%) - 563 UGO dont 468 symptomatiques Positifs NG : 0 33

Conclusion Fréquence chez les sujets asympto = 0,34 % (2/588) Fréquence chez les sujets sympto = 0,61 % (3/492)  Au total : 5/1080 soit 0,46 %

2011 - août 2012 6251 prélèvements recherche de NG sur prescription : 361 291 CIDDIST 45 UGO 18 extérieurs 7 prison Positifs CT : 4,7 % (293) Positifs NG : 0,66 % (41) (0,46 % en 2010) recherche sur prescription (18/361) : 4,99 % recherche systématique (23/5889) : 0,39 %

CONCLUSION

Neisseria gonorrhoeae Patient symptomatique : culture = gold standard homme : écoulement, urètre femme : sécrétions endocol SAUF localisations anales et pharyngées : biologie moléculaire (sensibilité >> culture) La culture peut être associée à la biologie moléculaire si les conditions de transport risquent d’affecter la survie de NG (délai d’acheminement, température).

Personne asymptomatique (dépistage) : biologie moléculaire (tests multiplex NG/CT) performance > culture prélèvements non invasifs (meilleure acceptabilité) homme : 1er jet urine femme : auto-prélèvement vaginal si positif : confirmer par 2ème technique de biologie moléculaire ciblant une séquence différente (taux prévalence population dépistée < 5%) reprélever pour culture et antibiogramme tests multiplex NG / CT cf : - fréquence co-infections (33 % selon CNR gono, 20-50 % selon études) - avantages d’un point de vue économique et organisationnel (coût additionnel faible) - prépondérance des tests multiplex sur le marché français

Chlamydia trachomatis Toutes les recherches s’effectuent par techniques moléculaires. homme sympto/asympto : 1er jet urine (urètre) femme symptomatique : endocol (+ urètre ou vagin) asymptomatique : auto-plvt vaginal (1er jet urine) femme sympto : asso urètre ou vagin pour augmenter les chances de diagno - femme asympto : auto-plvt meilleur que urine

Merci de votre attention…