Anciens et Nouveaux Virus Respiratoires Laurent Andréoletti (PU-PH) Laboratoire de Virologie Médicale et Moléculaire, EA/IFR53 CHU et Faculté de Médecine de Reims

Virus et Infections Respiratoires Infections respiratoires hautes Rhinite Otite Pharyngite Laryngite Infections respiratoires basses Bronchites Bronchiolites Pneumonies Enfants <2ans/ 0-5 ans Adultes immunocompétents Adultes immunodéprimés Personnes âgées > 65ans Communautaires et /ou Nosocomiales

Infections Respiratoires Communautaires Incidence annuelle de la pneumonie communautaire aiguë Enfants > adultes de moins 75 ans ++ Enfants de moins de 5ans: 34 to 40 cases per 1000 (Europe et USA) Pays en voie de développement =Europe = USA McIntosh K, NEJM, 2002 Etiologie des pneumopathies communautaires aiguës de l’enfant Virale dans 25 à 60 % des cas McIntosh K, NEJM, 2002

Virus et Infections Respiratoires Basses de l’Enfant Bronchiolite 460 000 cas /an (30 % de la population des moins de 2 ans) Hospitalisations: augmentation de 9 % par an Bronchiolites récidivantes= d’hyperréactivité bronchique  développement de l’asthme infantile Exacerbation de l’asthme infantile 100 000 consultations /an aux urgences en France (2006)

Virus et Infections Respiratoires Basses de l’Enfant En 2002 McIntosh K, NEJM, 2002

Anciens et Nouveaux Virus Respiratoires en 2008 BOCAVIRUS Parvoviridae ADN POLYOMAVIRUS KI & HU Polyomaviridae ADN

Virus et Pathologies Respiratoires Infections respiratoires hautes RVH, Coronavirus , hMPV para influenza: Rhinite VRS, Adenovirus Otite Adenovirus Parainfluenza Pharyngite ParaInfluenza Laryngite Infections respiratoires basses VRS, Influenza ParaInfluenza Coronavirus NL63,HKU hMPV Bocavirus Polyomavirus KI, HU Bronchites Bronchiolites Pneumonies Anciens virus nouvellement identifiés

Physiopathologie des Infections virales Respiratoires VRS: la réponse inflammatoire participe au pouvoir pathogène Days after infection Oppenshaw, 2007 ESCV, Lyon

Epidemiologie des infections respiratoires virales

Possibilités de co-infections respiratoires Infections virales au cours du temps chez des enfants souffrant de Bronchiolite RSV HRVs EVs RSV HMPV HRVs EVs HMPV Possibilités de co-infections respiratoires Jacques et al. JCV 2006 Jaarti et al. EID 2004

Pourquoi documenter les infections virales respiratoires ?? Permet d’établir un diagnostic étiologique Prévention des infections nosocomiales Diminution de la prescription inadaptée d’Antibiotiques Utilisation rationnelle d’antiviraux Suivi épidémiologique et virologique Meilleure prise en charge des patients

Infection virale respiratoire : Le prélèvement nasopharyngé Prélèvement de référence en pédiatrie chez les 0 à 4 ans (CDC , WHO , 2007)

Infection virale respiratoire : Le prélèvement nasal Prélèvement de référence pour les virus Influenza chez l’adulte (Invs 2008) A Virocult B Pasteur CNR grippe GROG Prélèvement nasopharyngé à stocker à 4°c

Diagnostic virologique Recherche des anticorps = Sérologie = Diagnostic indirect Recherche du virus ou de ses constituants = Diagnostic direct

Diagnostic virologique direct Culture cellulaire classique: MRC-5 MA-104 MDCK MA-104 MA-104 Detection des Antigènes viraux par IF ou techniques EIA Séroneutraisation sur culture par Ac Detection moléculaire et identification par séquençage moléculaire: PCR Temps réel, TA cloning, séquençage des gènes codant pour les protéines de surface ou de capside Standard colorations were performed to detect necroting and healing lesions and allowed to classify the different subgroups of patients and subjects Ev markers of infection were detected in four ventricular samples and in coronary thrombotic sections when it was possible VP1 allowed us to display a protein synthesis activity in cardiac tissues Molecular identification and phylogenetic comparison of EV strains was performed by PCR amplification, TA cloning and sequencing of a part of the VP1 capsid gene

Détection des antigènes viraux par Immunofluorescence Cellule épithéliale respiratoire Influenza A Anticorps monoclonal Influenza B Microscope VRS uv Identification Para influenza I, II, III Adénovirus Rendu des résultats en 4 heures

Détection des virus respiratoires par culture cellulaire Cellule épithéliale respiratoire infectée virus libres Anticorps monoclonaux Cellules permissives En culture Rendu des résultats en 3 à 6 jours

Diagnostic virologique moléculaire Detection moléculaire et identification par séquençage moléculaire: PCR Temps réel TA cloning, séquençage Standard colorations were performed to detect necroting and healing lesions and allowed to classify the different subgroups of patients and subjects Ev markers of infection were detected in four ventricular samples and in coronary thrombotic sections when it was possible VP1 allowed us to display a protein synthesis activity in cardiac tissues Molecular identification and phylogenetic comparison of EV strains was performed by PCR amplification, TA cloning and sequencing of a part of the VP1 capsid gene Développement des test de RT-PCR Temps réel multiplex (9 à 12 virus respiratoires) Augmentation significative des taux de détection des virus respiratoires + 40 à +65 % de positivité

Barrettes de 8 puces à ADN

Exemple d’interprétation d’une puce à ADN Genomica Exemple d’interprétation d’une puce à ADN Genomica. Positif RSV A et Bocavirus Carré servant à aligner la Grille de lecture RSV A RSV A Carré servant à aligner la Grille de lecture BOC 1 BOC 1 BOC 2 CI Témoin de révélation CI RSV A BOC 1 Témoin de révélation BOC 2 BOC 2 CI Carré servant à aligner la Grille de lecture

Diagnostic virologique classique des souches virales < 3 jours après le début des signes cliniques Ecouvillons- Nez-pharynx-Aspiration Rhinopharyngée Examen immédiat Immunofluorescence (IF), EIA Détection des antigènes NP A&B 30Min. à 2 heures IF RT-PCR 2 jours Virus Influenza A Culture virale, Labo L2 MDCK+Trypsine 2 à 4 jours IF Virus Influenza B Test rapide EIA

CONCLUSIONS Virus respiratoires : Rôle dans la bronchiolite Exacerbation de l’asthme infantile Infections graves chez les greffés de poumons Infections communautaires en réanimation Infections nosocomiales Virus nouvellement découverts: BOCAVIRUS, SAFFOLD, hMPV rôle agent étiologique ou de cofacteur à démonter !! Virus émergents : Recombinaison virus animal et humain: coronavirus, influenza Risque pandémique!! Virus respiratoires : diagnostic classique; culture cellulaire, EIA, IF Virus respiratoires : Diagnostic Moléculaire RT-PCR multiplex, Avenir puces ADN: combinaison: bactéries+virus