DEATH SIGNAL-INDUCED LOCALISATION OF P53 TO MITOCHONDRIA The Journal of Biological Chemistry, 2000 DEATH SIGNAL-INDUCED LOCALISATION OF P53 TO MITOCHONDRIA Natalie D. Marchenko, Alexander Zaika, and Ute M. Moll Claire BOUYER, Adrien LEMAIRE MSBi105, 2009

INTRODUCTION Rôle et Régulation de P53 Tiré du cours 2009 de F.RENAUD Rôle dans la suppression des tumeurs Rôle dans le cycle cellulaire Facteur de transcription Rôle dans l’induction de l’apoptose Activer par des facteurs de stress Inactiver par des virus oncogènes Dégrader par mdm2 Tiré du cours 2009 de F.RENAUD

INTRODUCTION Structure de P53 Domaine de transactivation Domaine de liaison à l’ADN Domaine d’oligomérisation : Homotétramérisation

INTRODUCTION Voie de l’apoptose indépendante de P53

Voie de l’apoptose dépendante de P53 INTRODUCTION Voie de l’apoptose dépendante de P53 Role de la mito dans l’apoptose : Potentiel de membrane Relarguage du cyto c Activation de la caspase 3

INTRODUCTION ETUDE DE LA VOIE NON GENOMIQUE DE P53

Effet Reproductible de la localisation de P53 à la mitochondrie RESULTATS Effet Reproductible de la localisation de P53 à la mitochondrie Expérience 1 : Mêmes résultats dans : Les cellules MCF-7 de cancer du sein Les cellules 32D immortelles myéloides de souris Les cellules pré-B (Baf-3) de souris Qui sont sauvage pour P53 Western-blot dans les cellules RKO Campthothécine : Dommage de l’ADN ML-1 : cellule de leucémie myéloide RKO : cellule de cancer du colon Western-blot dans les cellules ML-1  La relocalisation de P53 à la mitochondrie est un phénomène reproductible entre différents types de lignées cellulaires lors d’une apoptose médié par P53

Effet Reproductible de la localisation de P53 à la mitochondrie RESULTATS Effet Reproductible de la localisation de P53 à la mitochondrie Expérience 1 : Western-blot dans les cellules ML-1 Campthothécine : Dommage de l’ADN Desferroxamine (DXE) : stress hypoxique  La relocalisation de P53 à la mitochondrie est un phénomène reproductible après induction de différents types de stress cellulaire dans l’apoptose médié par P53

Choix de la voie induite par P53 après un stress RESULTATS Choix de la voie induite par P53 après un stress Expérience 2a : Cytométrie en flux des cellules ML-1  Actinomycine D : arrêt du cycle cellulaire en G1, pas d’activation de l’apoptose.  Camptothécine et Etoposide : Activation de l’apoptose médiée par P53.  La voie de P53 induite dépend de la drogue utilisée

RESULTATS P53 se localise à la mitochondrie uniquement lorsqu’il induit l’apoptose Expérience 2b : WB des cellules ML-1 TNF : Activation de l’apoptose indépendante de P53 Actinomycine D : Activation de l’arrêt du cycle cellulaire par P53 Campthomycine : Activation de l’apoptose dépendante de P53  La localisation de P53 à la mitochondrie est un phénomène spécifique de la mort cellulaire par apoptose médiée par P53

RESULTATS Accumulation spécifique de P53 à la mitochondrie lors de l’apoptose médiée par P53 Expérience 2c : Etude de la localisation de P53 après induction de l’apoptose médiée par P53 ou de l’arrêt du cycle cellulaire 2 voies : apoptose et arrêt du cycle cellulaire Actinomycine D : induction de l’arrêt du cycle cellulaire Camptothécine et Etoposide : Activation de l’apoptose médiée par P53 Western-blot dans les cellules ML-1  Il n’y a pas de P53 qui relocalise à la mitochondrie lors de l’activation de l’arrêt du cycle cellulaire par P53

Cinétique de l’accumulation de P53 à la mitochondrie RESULTATS Cinétique de l’accumulation de P53 à la mitochondrie Expérience 3a : Etude de la cinétique de localisation de P53 à la mitochondrie et du relargage du cytochrome c Accumulation de P53 à la mitochondrie dès 1h d’incubation en présence de Campthomécine Augmentation du taux de P53 après induction de Campt dans la mitochondrie dès 1h Fraction pure des mito par rapport à l’absence de PCNA à la mito L’augmentation de P53 précede le relargarge du cyto c (4h) et l’activation des caspases (4h) par clivage de Casp-3. Le cyto c va ensuite formé l’apoptosome avec apaf-1 et la caspase 9 pour activer les caspases Relargage du cytochrome c après 4h Activation des caspases après 4h Western-blot dans les cellules ML-1

Cinétique de l’accumulation de P53 à la mitochondrie RESULTATS Cinétique de l’accumulation de P53 à la mitochondrie Expérience 3b: Etude de la cinétique de la variation du potentiel de membrane de la mitochondrie Cytométrie en flux C’est grâce au potentiel de membrane de la mito que la rhodamine entre dans les cellules. Lorsque les cellules sont apoptotiques, elles n’ont plus de potentiel de membrane donc elle n’incorpore pas la rhodamine Rhodamine 123 : marqueur lipophile sonde du potentiel membranaire Changement de potentiel de membrane après 4h dans les cellules apoptotiques  La localisation de P53 à la mitochondrie précède l’apoptose et n’est pas une conséquence de l’apoptose

Localisation de P53 à la mitochondrie RESULTATS Localisation de P53 à la mitochondrie Expérience 4a: Cytométrie en flux de mitochondries isolées des cellules ML-1 Cyto ox IV : marqueur protéique de la membrane interne de la mitochondrie Avant apoptose : Cyto ox à l’intérieur de la mitochondrie donc non accessible à l’Anticorps Après apoptose : degradation de la membrane externe de la mitochondrie, Cyto ox IV dans la membrane interne de la mitochondrie est accessible  On observe un profil identique des Anticorps anti-P53 et anti-Cyto ox IV

Localisation de P53 à la mitochondrie RESULTATS Localisation de P53 à la mitochondrie Expérience 4b: Microscopie Electronique des particules d’or Anti-P53 Quantification des particules d’or Anti-P53 avant ou après traitement à la campthothécine à la mitochondrie  P53 à la mitochondrie se situe dans l’espace inter membranaire

Localisation de P53 à la mitochondrie RESULTATS Localisation de P53 à la mitochondrie Expérience 4c: Etude de l’association de P53 à la mitochondrie Mthsp70 (Anticorps monoclonal)=Grp75 (Anticorps polyclonale) : moteur de la transclocation des protéines à l’intérieur de la mitochondrie  Co-IP de P53 et mthsp70 Immunoprécipitation et WB dans des mitochondries de ML-1  La localisation principale de P53 à la mitochondrie est interne à la mitochondrie après translocation de la membrane par mtHSP70

Système EB1 : une lignée cellulaire du colon humain stable RESULTATS Induction de l’apoptose médiée par P53 dans des cellules déficientes pour P53 Expérience 5b: Système EB1 : une lignée cellulaire du colon humain stable - Homozygotes mutants pour la déletion de P53  pas d’apoptose médiée par P53 - Expression de P53 sous contrôle de la Métallothionine (ZnCl2) Avantages : - La réponse apoptotique sera uniquement due à l’expression de P53 et non à l’induction d’un stress  ce qui évite les effets pléiotropes des dommages de l’ADN Si l’accumulation de P53 à la mito est associé et precede l’acquisition de l’apoptose dans les cellules deficientes pour P53 après expression de P53 - Régulation précise de l’expression de P53 - Les cellules EB1 sont un bon type cellulaire pour l’étude de l’apoptose médiée par P53

RESULTATS Induction de l’apoptose médiée par P53 dans des cellules déficientes pour P53 Expérience 5b: Pas de P53 si non induction du système Présence de P53 après son induction (8,5h) par ZnCl2 Présence de P53 à la mitochondrie à un niveau similaire au ML-1  caractérise l’induction de l’apoptose  Les cellules déficientes pour P53 pourraeint entrer en apoptose médiée par P53 après induction de l’expression de P53 et accumulation de P53 à la mitochondrie

RESULTATS Etude du rôle des régulateurs mitochondriaux de l’apoptose sur la localisation de P53 à la mitochondrie Expérience 5c : Surexpression de Bcl-xL et Bcl-2 anti apoptotique dans les cellules 32D de souris Diminution de la mort cellulaire après surexpression de Bcl-xL Pas de P53 si surexpression de Bcl-2 ou Bcl-xL contrairement au contrôle  La famille Bcl-2 annule l’effet apoptotique de P53 à la mitochondrie  Il y a un lien direct ou indirect entre P53 et les protéines de la famille de Bcl-2 au niveau de la mitochondrie

Expérience 6 : RESULTATS Induction de l’apoptose lors d’un d’un adressage direct de p53 à la mitochondrie en contexte p53 déficient

Expérience 6 : suite RESULTATS Induction de l’apoptose lors d’un d’un adressage direct de p53 à la mitochondrie en contexte p53 déficient

CONCLUSIONS Une fraction de p53 se localise à la mitochondrie en cas d’apoptose médiée par p53. Phénomène reproductible dans un large spectre de cellules et de stress. Absence de cet évènement en cas d’apoptose p53-indépendante. De même lors d’un arrêt du cycle en G1 médié par p53. Phénomène rapide (environ 1h) précédant les évènement mitochondriaux. Bcl-2 et Bcl-xL capables de bloquer localisation mitochondriale de p53 lors d’un stress induit et apoptose dépendante de p53. p53 capable d’induire l’apoptose en l’absence d’action transcriptionnelle (attention au contexte de surexpression) Ce serait un enhancer de la voie principale qui repose sur les activités de facteur de transcription de P53.

PERSPECTIVES Ils posent en perspective quelles sont les protéines susceptibles d’interagir avec p53 et quels sont les régulateurs de l’apoptose qui sont activés en réponse. p53 agirait en monomère pour son action non-transcriptionnelle. Des études récentes ont montré que p53 peut directement induire la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe et permettre ainsi le relargage du cytochrome c et l’apoptose.