PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse NATIONALE VETERINAIRE T O U L O U S E Le site d’infection Pour aller sur notre site si vous avez récupéré nos diapositives ailleurs Update mars 2012 P.L. TOUTAIN PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse Les 3 questions auxquelles on doit répondre avant d’entreprendre une antibiothérapie Où se trouve le site d’action de l’antibiotique (biophase) Où est localisé le pathogène: en intra- ou en extracellulaire ? Quelle est la signification thérapeutique des concentrations tissulaires? PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Q1: où est localisé le pathogène PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse Le site d’infection Point de départ: toujours tissulaire La bactériémie: présence transitoire de bactéries dans le sang correspondant au passage du pathogène du foyer initial d’infection vers la circulation La voie sanguine assure la diffusion de l’infection La multiplication du pathogène dans le sang est minimale ou nulle PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse Le cas des mammites Pathogènes Lait Canaux Parenchyme Vache Inf.systèmique Streptococcus agalactiae +++ - Streptococcus spp + Staphylococcus aureus Staphylococcus spp Coliformes Mycoplasmes, autres GN PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Localisation des pathogènes Liquide interstitiels La plupart des pathogènes S. Pneumoniae, E. Coli, Klebsiella Mannhemia ; Pasteurella Actinobacillius pleuropneumoniae Mycoplasma hyopneumoniae Bordetalla bronchiseptica Cellule (le plus souvent des phagocytes) Mycoplasma (some) Chlamydiae Brucella Cryptosporidiosis Listeria monocytogene Salmonella Mycobacteria Rhodococcus equi

Le site d’infection extracellulaire La pupart des pathogènes sont extracellulaires Ils se multiplient en dehors de la cellule c.à.d dans l’espace interstitiel Ces pathogènes peuvent être phagocytés par des macrophages ou des neutrophiles professionnels PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Les bactéries extracellulaires Peuvent se multiplier en dehors des cellules. Elles causent la maladie par 2 mécanismes principaux. Induction d’une inflammation . Elles produisent des toxines (possibilité de choc septique). Endotoxines. Exotoxines. Les mécanismes de défense visent à éliminer la bactérie et à neutraliser les effets des toxines , e.g., in the circulation, in extracellular connective tissues, and in various tissue spaces such as the airways genitourinary tract, and intestinal lumens. ., resulting in tissue destruction at the site of infection which are components of bacterial cell walls ., which are actively secreted by the bacteria. PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse Q2: où est la biophase PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse La concentration plasmatique libre de l’antibiotique est celle qui contrôle la concentration de la biophase Barrières physiologiques: cerveau, prostate, rétine Pathologiques (caillot, abcès, …) AB Liée AB Libre Bactérie Cellule Cytosol AB liée AB libre Diffusion/perméabilité L LEC = biophase L organites AUClibre plasma = AUC libre LEC (biophase) PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse Conséquence de la localisation extracellulaire des pathogènes : La concentration plasmatique libre de l’antibiotique est celle qui contrôle la concentration de la biophase PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Concentrations (µg/mL) Activité Activité des antibiotiques selon la localisation intra- ou extracellulaire du pathogène Modèle in vitro où la même quantité d’antibiotique a été ajoutée pour voir l’efficacité sur Legionella (intracellulaire) ou sur S. aureus (extracellulaire) dans une suspension de macrophages, fibroblastes, PNN..; Même quantité d’antibiotique ajoutée S.aureus, legionella pneumonia, en suspension Concentrations (µg/mL) Activité Legionella S. Aureus Amoxicilline 0.94 ND non oui Erythromycine 0.08 0.88 oui non Clarithomycine 0.37 0.66 oui oui Extracellaire Intracellulaire Extracellulaire PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse Scanglione et al. 1992

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse Dans les infections aiguës des tissus non spécialisés, et en absence d’abcès, les concentrations plasmatiques libres en antibiotique sont similaires aux concentrations dans la biophase et elles servent de marqueur d’exposition PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse Les indices PK/PD sont tous basés sur des concentrations plasmatiques libres et non tissulaires PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse Conséquence de la localisation extracellulaire de la plupart des pathogènes: la non signification thérapeutiques des concentrations tissulaires totales Comparison of tissue concentrations with MIC should be strongly discouraged (O. Cars 1997) The best surrogate marker is the plasma free antibiotic concentration PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse Les sites subcellulaires d’infection pour les pathogènes intracellulaires facultatifs & obligatoires PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Les sites d’infection possibles Intracellulaires (obligatoires) Chlamydiae Rickettsia Brucella Lawsonia intracellularis (enterite proliferative du porc) Rhodococcus equi 3 localisations possibles despathogènes Extracellulaires S. pneumoniae E. coli Klebsiella Mannhemia; pasteurella Actinobacillius pleuropneumoniae Mycoplasma hyopneumoniae Bordetala bronchoseptica Intracellular (facultatifs) S. aureus (mammites) S. typhi Listeria Mycobacterium tuberculosis Streptococcus suis

Le site d’infection pour les pathogènes intracellulaires facultatifs Développement initial dans l’espace interstitiel Phagocytoses par les neutrophiles et les macrophages Survie du germe aux mécanismes de destruction des phagocytes Peuvent survivre dans les phagocytes (et même s’y multiplier) PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Les pathogènes intracellulaires obligatoires Sont incapables de se répliquer en dehors d’une cellule hôte La cellule assure le support nutritif pour la croissance du germe PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Localisation intracellulaire des pathogènes Fusion Lysosome B 3 pH=7.4 Phagosome Phagolysosome B 4 B 1 B S.aureaus Brucella Salmonella Coxiella burneti pH=5.0 B B B 2 Chlamydiae B No fusion with lysosome Listeria Cytosol PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Aspects cinétiques pour une antibiothérapie intracellulaire Quels sont les antibiotiques qui passent dans les cellules ? Où se localise l’antibiotique dans la cellule Quelle est l’activité de l’antibiotique dans un milieu intracellulaire ? Quelle est la coopération entre l’antibiotique et les mécanismes de défense des cellules (cytokines)? PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Localisation intracellulaire des antibiotiques Phagolysosome volume 1 to 5% of cell volume pH=5.0 Cytosol pH=7.4 Fluoroquinolones(x2-8) beta-lactams (x0.2-0.6) Rifampicin (x2) Aminoglycosides (slow) Macrolides (x10-50) Aminoglycosides (x2-4) Ion trapping for weak base with high pKa value PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Localisation intracellulaire des antibiotiques Les aminoglycosides, lincosamides et macrolides sont des bases faibles Leur localisation intracellulaire est principalement les phagolysosomes don’t le pH est acide ( 50% des quantités d’antibiotique alors que les phagolysosomes ne représentent que 2- 5% du volume cellulaire) Barza Clin. Inf. Dis., 1994 PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Activité des AB dans le milieu intracellulaire Phagolysosome Cytosol pH=7.2 Fluoroquinolones beta-lactams Rifampicin Aminoglycosides Good Macrolides Aminoglycosides Low or nul PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Activité des antibiotiques dans les phagolysosomes Les bases faibles (macrolides, aminoglycosides) ont une activité très diminuées en milieu acide car elles deviennent ionisées et ne peuvent plus pénétrer dans le pathogène PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Activité des antibiotiques dans les phagolysosomes La Rifampine, la vancomycine, les quinolones, la clindamycine sont actives contre les pathogènes phagocytés par les granulocytes PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Quelle est la sensibilité des pathogènes intracellulaires vis à vis des antibiotiques Dans le cytosol excellente Dans l’endosomes: ? Cytosol Les endosomes sont des sous compartiments de la cellule, ou organites (organelles), sur lesquels les vésicules d'endocytose s'accrochent et fusionnent pour relarguer leur contenu (les molécules qui étaient à la surface de la cellule et qui ont été internalisées à l'intérieur d'une vésicule d'endocytose). Dans le phagosomes Probablement excellente Dans le phagolysosome Très variable

acidité, protéines cationiques... Coopération de l’antibiotique avec les mécanismes de défense cellulaires Dans le cytosol inprobable Dans l’endosomes: probable Cytosol Les endosomes sont des sous compartiments de la cellule, ou organites (organelles), sur lesquels les vésicules d'endocytose s'accrochent et fusionnent pour relarguer leur contenu (les molécules qui étaient à la surface de la cellule et qui ont été internalisées à l'intérieur d'une vésicule d'endocytose). Dans le phagolysosome Très variable Dans le phagosomes probable Myéloperoxydase acidité, protéines cationiques...

La question des concentrations tissulaires (totales) en antibiotique PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse La communication des firmes pharmaceutiques sur les concentrations totales en antibiotique dans un tissu Nombreuses publications en MV pour promouvoir l’idée que les antibiotiques ayant des concentrations tissulaires totales élevées (quinolones et surtout, macrolides) sont plus efficaces que ne le suggèrent les faibles concentrations plasmatiques Tulathromycine PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Ne pas confondre science, publicité rédactionnelle et marketing Vrai mais les pathogènes ne sont pas là PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse Ne pas confondre science, publicité rédactionnelle et marketing pour la tildipirosine PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse Ne pas confondre science, publicité rédactionnelle et marketing pour la marbofloxacine PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Considérations marketing Il est plus facile de promouvoir la vente d’un macrolide en vantant ses grandes concentrations tissulaires qu’en expliquant pourquoi de faibles concentrations plasmatiques sont efficaces PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Que disent les scientifiques? PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse Statements such as ‘concentrations in tissue x h after dosing are much higher than the MICs for common pathogens that cause disease’ are meaningless Mouton & al JAC 2007 PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

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Pourquoi une concentration tissulaire totale n’a pas de signification thérapeutique Elle est obtenue sur un homogénat tissulaire l’AB n’est pas réparti de façon homogène dans un tissu (LEC vs. intracellulaire) et à l’intérieur de la cellule, la répartition peut être très hétérogène (cytosol vs phagolysosome) Il en résulte qu’une concentration tissulaire totale peut tout aussi bien sous-estimer (bêtalactamines, aminoglycosides) que surestimer (quinolones, macrolides) les concentrations de la biophase (généralement extracellulaire

Effet de l’azithromycine sur une ostéomyélite à staphylococcus Infection expérimentale s. aureus (MIC=1 µg/mL) Traitement: azithromycine 50 mg/kg PO 21 days PK: sérum : Cmax = 0.63 µg/mL os (infecté): Cmax jusqu’à 92.7 µg/g i.e. 90 fois laCMI Efficacité: Mauvaise en dépit de grandes concentrations dans l’os Hypothèses Activité réduite à pH=5 séquestration de l’ AB dans le secteur intracellulaire ou ne se trouve pas le pathogène O'Reilly et al. 1992, Antimicrob. Agent Chemother.

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse Méthodes actuelles pour l’étude des concentrations tissulaires des antibiotiques PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Microdialyse & ultrafiltration PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Qu’est-ce que la microdialyse ? La microdialyse est une technique mis en œuvre pour évaluer la concentration libre d’une substance (antibiotique) dans un liquide biologique qui baigne le pathogène (biophase) PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Microdialyse: Principe La sonde de microdialyse se comporte sur le plan des échanges avec le milieu extracellulaire comme un capillaire sanguin Diffusion of drugs is across a semipermeable membrane at the tip of an MD probe implanted into the ISF of the tissue of interest. There is an exchange of substances via extracellular fluid PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Qu’avons-nous appris des études de microdialyse? PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse Similarité des concentrations libres de la substances (Moxifloxacine) et des concentrations dans les liquides interstitels du muscle et du tissu adipeux Total (plasma, muscle) free (plasma) interstitial muscle interstitial adipose tissue 1000 Concentration (ng/mL) 100 2 6 10 12 20 30 40 Time (h) PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse Muller AAC, 1999

Qu’avons-nous appris des études de microdialyse en cas d’inflammation? PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Bellmann & al Br J Clin Pharmacol 2004 57 Tissue concentrations of levofloxacin in inflamed and healthy subcutaneous adipose tissue Hypothesis: Accumulation of fibrin and other proteins, oedema, changed pH and altered capillary permeability may result in local penetration barriers for drugs Methods: Free Concentrations measured by microdialysis after administration of a single intravenous dose of 500 mg. Inflammation No inflammation Results:The penetration of levofloxacin into tissue appears to be unaffected by local inflammation. Same results obtained with others quinolones Bellmann & al Br J Clin Pharmacol 2004 57

Qu’avons-nous appris des études de microdialyse en cas d’inflammation? Une inflammmation aiguë a peu d’influence sur la pénétration tissulaire des antibiotiques “These observations are in clear contrast to reports on the increase in the target site availability of antibiotics by macrophage drug uptake and the preferential release of antibiotics at the target site a concept which is also used as a marketing strategy by the drug industry” Muller & al AAC May 2004 PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

La question des concentrations pulmonaires en antibiotique PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Animal and human studies MD: The issue of lung penetration Lung MD require maintenance under anesthesia, thoracotomy (patient undergoing lung surgery).. Does the unbound concentrations in muscle that are relatively accessible constitute reasonable predictors of the unbound concentrations in lung tissue (and other tissues)? PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Cefpodoxime at steady state: plasma vs. ISF (muscle & Lung) Free plasma Muscle Lung Free muscle concentrations of cepodoxime were similar to free lung concentration and therefore provided a surrogate measure of cefpodoxime concentraion at the pulmonary target site Liu et al., JAC, 2002 50 Suppl: 19-22. PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

The blood-alveolar barrier Fenestrated pulmonary capillary bed expected to permit passive diffusion of antibiotics with a molecular weight 1,000 The blood-alveolar barrier ISF Capillary wall Alveolar Epithelium Thigh junctions space macrophage AB Epithelial lining fluid ELF The alveolar epithelial cells would not be expected to permit passive diffusion of antibiotics between cells, the cells being linked by tight junctions PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse Conclusion 1: In acute infections, in non-specialized tissues (no barrier), where there is no abscess formation, free serum levels of antibiotics are good predictors of free levels in tissue fluid and must be used to establish PK/PD indices PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse Conclusion 2 : Currently, no equivalent recommendation has been published with tissular concentration as PK input and that, for any tissue or any type of infection including intracellular infection. PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Some statements on total tissular concentrations For veterinary medicine (Apley, 1999) people who truly understand tissue concentration work in corporate marketing departments For human medicine (Kneer, 1993) tissular concentrations are inherently inaccurate tissular concentrations studies little contribute to the understanding of in vivo efficacy and optimal dosing PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Tissue concentrations According to EMEA "unreliable information is generated from assays of drug concentrations in whole tissues (e.g. homogenates)" EMEA 2000 PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse