Nouveaux tests immunologiques pour le diagnostic de la tuberculose Guislaine Carcelain Immunologie Cellulaire, Hôpital Pitié-Salpêtrière

balance entre le pathogène et les réponses immunes de l’hôte Formes cliniques balance entre le pathogène et les réponses immunes de l’hôte gouttelettes aérosols dans alvéoles pulmonaires phagocytose par macrophages alvéolaires, cellules dendritiques cellules T ganglions drainants Terrain +++ Guérison spontanée Éradication? Primo Infection 5-10% Réactivation 5-15% Infection latente > 90% Adapté de Kaufmann nature reviews 2001

Mise en place d’une boucle de réponse Th1 Production de molécules anti microbiales : RNI, ROI BK interfère Cl II, Cl I, phagocytose Échappement Persistance en Latence granulone  fusion phagosomes/lysosomes IFNg CD4 CD4-/8- CD8 Tgd Lyse IL12 CD4 mémoires effectrices (TEM) Contact récent ag fonction effectrice IFNg rapide CD4 mémoires centrales (TCM) Durée de vie longue>disparition ag prolifération rapide à ag Cellules T spécifiques Contrôlent mΦ infectés Adapté de Kaufmann nature reviews 2001

Hypersensibilité retardée à la tuberculine Réponse Mémoire T aux antigènes mycobactériens Présentation d’ag mycobactériens Mesure inflammation et induration + : virage chez non vacciné, >15 mm ou phlycténulaire chez vacciné  La Tuberculine : le plus vieux des antigènes mycobactérien - Koch’s old tuberculine, 1891 concentré de culture inactivé par la chaleur - Tuberculine Purified Protein Derivative (PPD) milieu sans protéines, soniqué, filtré, lots non standardisés > 200 ag partagés entre M tuberculosis, M Bovis, BGC, certaines M atypiques  IDR : non spécifique+++, peu reproductible, peu sensible (< 5 ans, ID …)

Nouveaux tests immunologiques de la tuberculose Alternatives in vitro à l’IDR : mesure de l’IFNg secrété par les cellules T (TEM) en réponse à une stimulation par des antigènes spécifiques Rationnel : si immunisation  fréquence Sang total ou CMNS Ag M Tuberculosis ESAT 6, CFP10 Incubation O/N ou 48h Sécretion IFNg mesure IFNg ELISA ELISpot IFNg pg/ml SFC/106 IGRAs Interferon Gamma Release Assays Adapté de Pai Lancet Infect Dis 2004

Facteurs contrôlant leur spécificité Séquence complète du génome de M Tuberculosis: (S. Cole Nature 1998) - Génome total : 4,4 millions pb - Gènes codants : 3,9 millions pb soit 90,8% - Gènes dont la fonction est connue : 2,4 millions pb Différences entre M Tuberculosis et BCG : Régions de Différence RD - 129 ORF présentes dans les isolats cliniques de MTb et absentes dans le génome des souches vaccinales BCG et la plupart des mycobactéries atypiques - 3 ag immunodominants spécifiques de Mtb codés par RD et inclus dans tests in vitro : ESAT 6/CFP10 (RD1, virulence), TB 7.7 (RD11)

Nouveaux tests immunologiques de la tuberculose disponibles dans le commerce, approuvés par la FDA, marquage CE Antigènes (peptides) : ESAT-6, CFP10 (RD1), +/- TB7.7 QuantiFERON-TB Gold in-Tube (Cellestis Limited, Canergie, Australia) T-SPOT.TB (Oxford Immunotech, Oxford, UK)  IGRAs : Avantages par rapport à l’IDR : Pas de seconde visite, résultats en 16-24 heures +/- Pas de stimulation in vivo des réponses immunes (effet « booster » IDR) Reproductibilité test et réactifs Résultat objectif Spécificité +++ : populations BCG+, infectées par MNT - Contrôle + : mitogène, met en évidence des faux nég = test in-interprétable

Interprétation : 3 résultats possibles  Résultat positif : fréquence élevée de cellules TEM (et Teff) spécifiques de MTb - VP : contage MTb responsable d’une stimulation spécifique de l’immunité mais attention le résultat reste qualitatif : Tuberculose Infection? / Tuberculose Maladie ? infection ancienne? / récente? risque d’évolution vers tuberculose Maladie? - FP : défaut de spécificité Peu probable sauf : M kansasii, M Marinum, M Szulgai …

Interprétation : 3 résultats possibles  Résultat négatif : fréquence nulle ou faible de cellules TEM et (TEff) spécifiques MTb - VN : absence de contage tuberculeux - FN : pb de sensibilité … . contage tuberculeux ancien? Frces faibles TEM, TE . stimulation trop brève : délais court pour activer TCM . choix des antigènes pb CMH certaines éthnies?  conséquence de ces FN? Risque ou non de réactivation? augmenter nombre ag? Stimulation plus longue?  Résultat indéterminé : production insuffisante d’IFN-g en présence de PHA Incapacité du SI à développer une réponse T fonctionnelle Comme l’IDR ils peuvent être affectés par l’ID +++ MAIS on le visualise +++ QTF > T-SPOT.TB (ajustement nbre lympho)

Pai M, Annals of Internal Medicine 2008 Spécificité (95% CI) estimée chez le sujet sain Sujets sains, régions faible endémie, ss ATCD ni exposition à MTb - QTF-G BCG- 8 études : 0.99% (0.98-1.00) - QTF-G BCG+ 8 études : 0.96% (0.94-0.98) - T-SPOT.TB BCG+ 6 études : 0.93% (0.86-1.00) - IDR BCG- 6 études : 0.97% (0.95-0.99) - IDR BCG+ 6 études : 0.59% (0.46-0.73)  Élevée, comparable, > IDR, non modifiée par BCG et peu par MNT (sf M Szulgai, M marimum, M kansasii …)  Sensibilité (95% CI) estimée chez le patient tuberculeux Sujets tuberculose prouvée, la plupart VIH- - QTF-G 16 études : 0.78% (0.73-0.82) - QTF-G IT 6 études : 0.70% (0.63-0.78) - T-SPOT.TB 13 études : 0.90% (0.86-0.93) - IDR 20 études : 0.77% (0.71-0.82)  Inférieure ou égale à celle de l’IDR, (T Mémoires centrales)?

IGRAs: rôle dans le diagnostic TB maladie? - Pas de détection du pathogène … mis au point pour détecter l’infection par MTb Possible cependant en situation particulières paucibacillaires: enfants, formes extrapulmonaires … (IGRAs Liquide Pleural revues en Joshi R 2008, IGRAs sang (Kim 2008)) - Mais problématique chez l’adulte : . un test positif ne fait pas la différence ITL / TBm  vrai problème en situation endémique . un test négatif : ne peut éliminer le dg de TBm  sensibilité non optimale : 80% en situation de TBm

IGRAs rôle dans le diagnostic d’une ITL Difficulté : pas de gold standard dg ITL Sujets exposition forte Sensibilité variable : QTF-G 44-74% , T-spot.TB 22-100%, IDR 0-90% (revu en Menzies Ann Intern Med 2007) Association test positif avec le degré d’exposition Sujets : >20.000 clients supermarché Hollandais, contacts employé TB+ > 17 ans, BGC-, suivi 10 mois, n= 785 IDR et IGRAs, Monovariée : probabilité IGRAs + corrélée frce shopping, expo cumulée Multivariée : probabilité IGRAs + corrélée au degré exposition cumulé alors que pas IDR+++, associée avec âge seulement (Arend Am J of Resp and Crit care Med 2007)  % de tests IGRAs positifs évoluant vers TBm ? Sujets contacts suivis 2ans, sous groupe de sujets non traités TAT : Evolution TBm : 5/219 (2.3%) IDR+ versus 6/41 (14.6%) QTF+ p< 0.003 Allemagne (Diel Am J Respir Crit Care Med 2008) Evolution TBm : 14/843 (1.7%) IDR+ versus 11/649 (1.7%) T-SPOT.TB Gambie (Hill Plos one 2008)

ITL : Prédiction risque de TB active? Rationnel : fréquence TEM, T eff corrélée charge antigénique . Taux élevés IFN-g prédictifs risque développement TBm . Notion d’ récente du taux IFN-g chez patients récemment exposés Seuil maladie seuil infection Adapté de Andersen Trends in Molecular Biology 2007 Guérison initiale ESAT 6- ITL ESAT 6+ Évolution sdaire TBm ESAT 6+  Forte association risque progression /forte réponse IFN-g ESAT-6 (Doherty J Clin Microbiol 2002) Risque progression corrélé à intensité des réponses dans un modèle animal (Weldingh Plos One 2008) Nécessite plus larges études: confirmer ce concept définir seuil, ou delta d’augmentation définir si ttt selon ce critère  risque TB Difficile +++

A-t-on une Réversion de ces réponses ? Effet du traitement antituberculeux : - TBm: diminuent sous traitement dès M3, significatif >M28 - ITL: diminution sous (3-5 mois) ou post traitement (3 mois) (Carrara 2004, Pathan 2001, Wilkinson 2006, Ewer 2006 …)  TEM , T eff nécessitent contact récent avec l’ag  disparition ou seuil de réversion? Mais: discordances (indiv, publications) (revue Pai, Lancet Inf Dis 2007) - Variabilités individuelles? - persistance d’une maladie active microbiobiologiquement? …  Evolution spontanée dans le temps de ces réponses : - Diminution? disparition? Sous l’effet de la «disparition» de l’ag? - Fluctuations techniques? fluctuations biologiques? attention réponses seuil +++, variations physio <16%? (Veerapathan 2008)  questions : la reproductibilité (réponses faibles ++), % de variation bio, signification réversion? définition des seuils de conversion, QTF / TSPOT.TB?

Le patient infecté par le VIH Sensibilité diminuée, cependant : - Sensibilité IDR très diminuée et faux négatifs - IGRAs plus sensibles que IDR dans cette population IDR 47-67% versus IGRAs 63-90% (lagrange 2008, Raby 2008) T-SPOT.TB moins affecté (Liebeschuetz 2004, Dheda 2005) - Très modifiée pour QTF par taux CD4/mm3 : <100 : 23%, 100-199 : 70%, 200-349 : 74%, > 350 : 88% (Raby 2008) Augmentation des Résultats Indéterminés : - QTF-G 11%, T-SPOT.TB 3%, p< 0.0001 corrélé à la présence d’un facteur de risque d’ID pour les deux tests (Ferrara 2005, 2006) - Supérieur pour QTF-G (11-24%), corrélé taux de CD4 QTF-G++ (Brock et al. Respir Res 2006) - T-SPOT.TB plus atteint par déficit fonctionnel que par taux de CD4 (Dheda et al AIDS 2005, Hoffmann AIDS 2007)

Conclusions et perspectives Un espoir pour avoir mieux que l’IDR ? Avoir un test plus spécifique : OUI Avoir un plus sensible : AUSSI sensible Avoir un test plus reproductible: OUI mais dans quelle mesure? Avoir un test en un seul temps : OUI mais pas plus rapide Avoir un test plus corrélé à l’exposition ? OUI Avoir un test prédictif du risque de progression vers la maladie? OUI probablement mais seuils ou delta de variation à définir Nécessité de larges études pour - Mieux définir l’évolution dans le temps de ces réponses (en cours) - Travailler sur l’aspect reproductible/quantitatif des réponses (en cours) - Evaluer sensibilité tests si «immunodépression» enfants, âgés, ID, (en cours) - Evaluer l’apport de ces tests dans les formes cliniques paucibacillaires - Augmenter la sensibilité des tests et capacité diagnostique (antigènes)