HEPATITES VIRALES B et C : TESTS BIOLOGIQUES 1 - les tests du diagnostic de l’infection 2 - les tests du bilan de gravité de la maladie hépatique 3 - les tests de l’évaluation pré-thérapeutique 4 - les tests du suivi des patients traités 5 - les tests du suivi des patients non traités M.Branger 2007-08

1 - le diagnostic de l’infection : A - le diagnostic d’un contact avec le virus :  mise en évidence d’anticorps par sérologie  diagnostic indirect - toujours précédés d’une « fenêtre pré-sérologique » . variable selon le virus . variable selon la méthode utilisée - dépendante de la capacité de réponse de l’hôte

1 - le diagnostic de l’infection : B - la mise en évidence de la réplication virale dans le sang :  détection du virus ou d’un de ses composants  diagnostic direct - détection du virus ( microscopie électronique , culture ..) . aucune technique de routine - détection d’une protéine virale : . antigène viral - détection (qualitative) de l’acide nucléique viral . toujours après amplification - détection d’une enzyme virale spécifique

2 – le bilan de gravité de la maladie hépatique : A - aucun test virologique ne permet d’apprécier l’état hépatique. Mais plutôt : - la biopsie hépatique, avec score des lésions (Métavir) . score d’activité . score de fibrose - les tests biologique ( Fibrotest ) - les tests physiques ( Fibroscan ) B - aucun test virologique n’a de valeur pronostique quant à l’évolution spontanée de la maladie

3 – l’évaluation pré- thérapeutique :  probabilité de réponse au traitement  choix du protocole thérapeutique A - outre les paramètres biochimiques : valeur des transaminases sur plusieurs dosages mensuels B - deux paramètres virologiques sont essentiels : - le typage du virus : . sérotype (sur les anticorps) . génotype (sur l’acide nucléique)

- la quantification du virus circulant : charge virale . très généralement par l’acide nucléique . méthodes nombreuses . hybridation abandonnée en Europe . PCR quantitative . bDNA . PCR temps réel . résultats exprimés en UI/ml C - d’autres paramètres secondaires : . âge à la contamination . sexe ..

Ranges of Linear Quantification of HCV RNA Assays (IU/ml) 10 102 103 104 105 106 107 108 PCR classique LCx HCV RNA Assay bDNA PCR temps réel Untreated hepatitis C

4 – l’évaluation de la réponse au traitement :  critères variables selon le virus  critères sérologiques ( HBV )  critères de biologie moléculaire ( HCV ) - on définit généralement : . une réponse virologique en fin de traitement . une réponse virologique à 6 mois (réponse soutenue) - on cherche à prévoir la probabilité d’une réponse soutenue au cours du traitement : . critères variables selon le virus, le type de traitement et la chronologie.

5 – le suivi des patients non traités : - suivi de l’infection hépatique : . transaminases . tests virologiques (semestriels ou annuels) . répétition des biopsies (5 ans) ou tests non invasifs - dépistage du CHC (semestriel) . alpha-foetoprotéine . échographie

HEPATITE C : DIAGNOSTIC et SUIVI BIOLOGIQUE Quelques notions de base : - virus enveloppé (inactivation virale des MDP) - virus à ARN simple brin de polarité positive  «  ARN messager » - réplication purement intra-cytoplasmique : clivage d’une polyprotéine par enzymes cellulaires et virales (cibles de nouveaux traitements : polymérase, …. ) - aucune forme de latence - aucune intégration dans le génome cellulaire

1 – le diagnostic de l’infection ( souvent asymptomatique) : A - la recherche d’un contact viral par détection d’anticorps (méthode ELISA) doit toujours être la première démarche : - fenêtre pré-sérologique longue et très variable en moyenne 66 jours (38 à 94) NB : fenêtre raccourcie par test combiné - une positivité (répétable) doit être confirmée : . sur un autre prélèvement . et par une autre méthode (autre ELISA) B - la détection d’ARN/HCV affirme la réplication virale : - par PCR (sensibilité 50 UI/ml) ou TMA (20 UI/ml) - la persistance > 6 mois affirme la chronicité - NB : test Ag HCV actuellement retiré

Hépatite C aiguë qui évolue vers la guérison + + + + + - - - - - - - - - - - - - HCV / ARN + + + + + - - - - - - - - - - - - - Ag HCV ANTICORPS ALT

Hépatite C aiguë qui évolue vers la chronicité + + + + + + + -? + + + + -? + + HCV / ARN + + + + + + + + + + + + + + + Ag HCV ANTICORPS ALT

 diagnostic dans des cas particuliers : 1 . devant une hépatite aigüe symptomatique : . étiologie virale probable . écarter les autres virus par les sérologies : ( HAV IgM, HEV IgM, Ag HBs, anti HBc IgM ) . détection d’ARN / HCV si sérologies négatives 2 . diagnostic chez un sujet immuno-déprimé, en l’absence d’anticorps : ajouter une détection de l’ARN/HCV . chez les hémodialysés ( évaluation en cours ) . bilan de l’infection par HIV avec ID marquée : . au moins une détection d’ARN / HCV . puis chaque année (?) selon les risques

3 . chez un sujet séro-positif et ARN/HCV non détectable : . répéter la détection d’ARN après 6 mois pour affirmer l’éradication de l’infection 4 . chez le nouveau-né de mère HCV+ et ARN/HCV+ : . présence d’anticorps passifs . détection d’ARN/HCV vers 2/3 mois d’âge ( des faux négatifs ont été décrits plus tôt ) . renouvelée vers 1 an d’âge si positive, pour faire le diagnostic d’infection chronique

2 – l’évaluation pré-thérapeutique : A - le typage du virus est toujours nécessaire : - 6 types principaux : de 1 à 6 - nombreux sous-types sans implication clinique claire - principal facteur de pronostic d’une bonne réponse au traitement (2 et 3 plus sensibles) et de choix du protocole ( traitement de 6 ou 12 mois) .

B - la quantification de l’ARN circulant ( charge virale ) - NB : pas de valeur pour prévoir l’évolution spontanée - mais valeur prédictive de la possibilité de réponse au traitement pour les types 1 et 4 - surtout point de départ pour la prédiction précoce d’une possible réponse, en cours de traitement - NB : ou par quantification de l’Ag HCV

3 – le suivi de la réponse au traitement : A - l’objectif est l’obtention d’une réponse soutenue (SR) - négativation (qualitative) de l’HCV/ARN circulant 6 mois après la fin du traitement (technique < 50 UI/ml) - équivalente à une guérison de l’infection ( < 2 % de récidives ) B - la réponse à la fin du traitement : - n’exclut pas une récidive - distingue les « rechuteurs » des « non répondeurs » - intérêt pour un éventuel traitement ultérieur

C - importance de la prédiction précoce d’un possible succès C - importance de la prédiction précoce d’un possible succès thérapeutique ( tt combiné PEG IFN + RBV ) : - à M6 : par la négativation (qualitative) de l’HCV/ARN - à S12 : par la baisse >= 2 log de la CV ( ou négativation de l’Ag HCV à S12 ? )  implication consensuelle : arrêt du tt en l’absence du critère prédictif - à S4 : grande valeur de la négativation de l’ARN ( études de protocoles de tt raccourcis )

HEPATITE B : DIAGNOSTIC et SUIVI BIOLOGIQUE Quelques notions de base : - virus enveloppé ( inactivation virale des MDP) - virus à ADN bicaténaire circulaire compacté par chevauchement des zones de lecture - réplication cytoplasmique et intra-nucléaire , . avec une étape de retro-transcription - forme de latence : DNA super-enroulé - intégration dans le génome cellulaire  une suite continue d’états de réplication depuis la latence la plus complète jusqu’à un niveau très élevé .

1 – le diagnostic de l’infection : A - la sérologie est très riche : 3 systèmes en routine . HBs : système « infection clinique » - Ag HBs : test diagnostique direct - anti HBs : anticorps de guérison, protecteur . HBc : système « contact » - « jamais » d’Ag HBc détectable - anti HBc présent tout au long de l’infection . HBe : système « réplication » - utile si Ag HBs + - indicateur surtout de réponse au traitement

Hépatite B aigüe qui évolue vers la guérison clinique (90%) Système HBs = infection clinique Ag HBs anti HBs

Système HBc = contact viral Anti HBc total Ig M

Système HBe = réplication virale Ag HBe Anti HBe

Ag HBs Anti HBc totaux Anti HBs S E C phase 1 phase 2 phase 3 phase 4

- phase 1 : infection . Ag HBs seul au début . puis accompagné d’anti HBc - phase 2 : guérison récente . anti HBc « isolé » . possible anti HBc IgM - phase 3 : immunisation . Anti HBs et anti HBs - phase 4 : immunisation ancienne . Anti HBc « isolé » NB : possibles anticorps passifs, réactivités non spécifiques

Hépatite B aigüe qui évolue vers la chronicité (phase précoce) Ag HBs > 6 mois anti HBc Ag HBe Anti HBc IgM

 règles d’utilisation des marqueurs (au plus 3 marqueurs par sérum) : - dépistage (sujet immunocompétent) : anti HBc - dépistage (sujet immunodéprimé) : 3 marqueurs usuels  ou Ag HBs et anti HBc selon l’ANAES 2003 - dépistage chez une femme enceinte : Ag HBs - étude de la réponse vaccinale : titrage d’anti HBs - diagnostic d’une hépatite aigüe : Ag HBs + anti HBc IgM - suivi d’une hépatite B chronique : Ag HBs + Ag HBe + Ac HBe - pour toute découverte d’Ag HBs positif . prélèvement de contrôle . test de neutralisation

1 – le diagnostic de l’infection : B – la recherche de l’HBV/DNA n’est indiquée (à l’étape du diagnostic) que face à une « insuffisance » dans la détection de l’Ag HBs : - défaut de sensibilité de la détection : exceptionnel - mutant non détectable : discordance des tests - hépatite B occulte : présence d’HBV/DNA dans le foie ou le sérum en l’absence d’Ag HBs ; généralement faible réplication ; surtout difficulté d’interprétation !  pas de test qualitatif très sensible standardisé  on utilise les tests de quantification : trop peu sensibles, sauf la PCR en temps réel

3 – l’évaluation pré-thérapeutique : A - le typage de l’HBV n’a pas encore d’indication claire en clinique : nombreuses études en cours - sérotype abandonné - génotype B - la recherche de mutations spontanées survenues au cours de l’infection : - mutations de la région core - surtout mutation pré-core : apparition d’un codon stop et impossibilité d’exprimer l’Ag HBe ; mais HBV/DNA élevé

C - la quantification de l’HBV/DNA circulant : charge virale - participe à la décision d’un traitement spécifique : . existence d’une réplication > 105 copies/ml . et de transaminases élevées - valeur prédictive d’une réponse au traitement : . la probabilité d’une réponse est bonne quand la charge virale est modérée

phase 1 phase 2 phase 3 phase 4 Ag HBs + + + + + + + + + + + + + + + - - - - + + + + Anti HBs - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + - - - Ag HBe + + + + + + + + - - - - - - - - - + + + + Anti HBe - - - - - - - + + + + + + + + + + + - - - HBV/DNA ALT phase 1 phase 2 phase 3 phase 4 Tolérance Elimination Non réplicative Réactivation

Phase 1 : tolérance de l’infection - HBV/DNA élevé - transaminases normales Phase 2 : rejet de l’infection - baisse de l’HBV/DNA - transaminases élevées Phase 3 : portage « non réplicatif » - HBV/DNA < 105 copies/ml - transaminases selon la durée de la phase 2 - possible disparition d’Ag HBs et immunisation Phase 4 : réactivation - peu de tendance spontanée à la résolution

4 – suivi des patients traités :  la sensibilité au traitement est définie par une chute précoce ( M3 ou M6 ) de la charge virale > 1 log  la réponse est suivie sur des bilans trimestriels : - bilan biochimique - bilan sérologique : l’objectif premier est la séro- conversion dans le système HBe - et charge virale : . quantification de la réponse obtenue . dépistage précoce de résistance au traitement

Importance de la technique de charge virale au cours du suivi > 1 log : sensibilité résistance 130 000 UI / ml efficacité 12 UI / ml

- l ’exploration de la résistance du HBV aux traitements : - si ré-ascension > 1 log de la charge virale sur 2 points - actuellement par tests génotypiques ( InnoLipa ou séquençage) - fréquence très variable selon les molécules : . 15 à 20 % par an pour lamivudine . 5 % après 3 ans pour adéfovir - NB : en début de tt spécifique , certains patients co- infectés par HIV ont déjà reçu des molécules actives .