Apport du laboratoire dans le diagnostic et le traitement des infections Le prélèvement. L’examen au laboratoire. Les relations entre le laboratoire et le service demandeur.

Le prélèvement : conditions générales (1) dans les règles de soins et d’hygiène avant l’administration d’antimicrobiens. le plus tôt possible dans le processus infectieux -au plus près du foyer initial (ou des lésions secondaires ) -éventuellement au niveau de la porte d’entrée et sur les voies d ’excrétion.

Le prélèvement : conditions générales (2) quantité la plus importante possible de matériel. méthodes différentes selon les micro-organismes recherchés, les organes à prélever, le type des lésions, l’enjeu du diagnostic.

Le prélèvement : conditions générales (3) éviter la contamination des prélèvements (bactéries de l’environnement et bactéries commensales) -> respect des règles d’hygiène -> matériel stérile à usage unique. -> dispositifs spéciaux -> décontamination de la surface à prélever

Le prélèvement : conditions de recueil dans un récipient : stérile, à usage unique étanche et fermé hermétiquement identifié : nom et prénom du malade, nature et site du prélèvement. date et heure du prélèvement. introduit dans un sac plastique étanche et fermé hermétiquement

Le prélèvement : conditions de transport (1) idéalement : prélèvement effectué au laboratoire. si transport de < 30 mm pour les petits échantillons ou de < 2 heures pour les autres : tube sec stérile. si transport de > 2 heures : inoculation dans un flacon d’hémoculture anaérobie et dans un tube sec stérile. conservation :- tube stérile: à +4°C * - flacon: à 37°C (ou t° ambiante) si transport de >24 heures: milieu de transport type Portagerm * sauf échantillons respiratoires et LCR

Le prélèvement : conditions de transport (2) cas spéciaux* nécessitant la congélation du prélèvement : recherche de - virus enveloppés, - Bartonella * contacter le laboratoire avant de prélever

Le prélèvement : refus d ’analyse échantillons reçus dans des récipients non étanches mal conservés non étiquetés inappropriés aux analyses prescrites même type d ’échantillon qu’un échantillon reçu le même jour (sauf hémoculture, LCR ou en cas d ’aggravation de la situation clinique).

Examen au laboratoire Diagnostic direct : mise en évidence de l’agent infectieux Diagnostic indirect : mise en évidence de la réaction de l’organisme à la multiplication de l’agent infectieux = sérologie

Les étapes de l ’examen bactériologique classique  examen microscopique  culture  tests de sensibilité aux antibiotiques

L ’examen microscopique (1) effectué directement sur le prélèvement, à l’état frais et après coloration de Gram (ou autre:ex, Z. Neelsen) résultats le jour même du prélèvement détecte la présence de: - bactéries (si suffisamment nombreuses) - polynucléaires neutrophiles

L ’examen microscopique (2): les bactéries flore polymorphe ou monomicrobienne cocci ou bacilles, mobiles ou non Gram+ ou Gram - -> indications pour le choix des milieux à ensemencer -> base pour interprétation du résultat des cultures. -> indications pour la mise en place du traitement

Coloration de Gram: cocci à gram positif

Coloration de Gram: bacilles à Gram négatif

L ’examen microscopique (3): les polynucléaires neutrophiles la présence de polynucléaires neutrophiles* ± altérés est en faveur d’une infection bactérienne. *cas des liquides de ponction : recherche par coloration cytologique (May Grunwald Giemsa)

La culture (1) sur différents milieux* : solides , liquides, enrichis , sélectifs , en aérobiose et parfois en anaérobiose. colonies en milieu solide et trouble en milieu liquide isolement impératif pour distinguer les différentes espèces présentes. *certaines espèces requièrent des milieux et des conditions de mise en culture spéciaux (mycobactéries, Rickettsies, Chlamydia).

La culture (2) résultats obtenus habituellement en 24 heures ( mais parfois plusieurs jours ou semaines selon les bactéries). -> permet de faire la détection des bactéries qui n’ont pas été observées à l’examen microscopique. l’appréciation quantitative des bactéries présentes. l ’identification des différentes espèces et si nécessaire l’antibiogramme.

L ’identification de la culture (1) effectuée par étude des caractères culturaux et biochimiques avec des trousses d ’identification commercialisées (gammes API) habituellement en quelques heures ( 24 heures ou moins )

L ’identification de la culture (2): cas des bactéries à croissance lente et/ou difficile -> étude des caractères génotypiques hybridation avec des sondes spécifiques en utilisant des trousses commercialisées (ex: sonde pour mycobactéries), résultats en quelques heures .

Test de sensibilité aux antibiotiques effectué par la technique de l’antibiogramme résultats en 24 h. -> aide à la mise en place du traitement spécifique: -indispensable en cas d’échec du traitement ou de rechute. - utile pour les espèces concernées par la résistance acquise* *résistance naturelle = partagée par toutes les souches d ’une même espèce. résistance acquise = concerne seulement certaines souches de l ’espèce.

Techniques de détection rapide 1. recherche d ’antigènes solubles. 2. amplification génique.

Recherche d ’antigènes solubles dans les urines, le LCR . en utilisant des anticorps connus, spécifiques de la bactérie recherchée résultats rapides (1 à 2 heures) pour : des infections à bactéries de croissance difficile (légionelle,pneumocoque) des infections décapitées (méningite) limites : manque de sensibilité

Amplification génique principe : multiplier le génome (une fraction spécifique) de la bactérie sans multiplier la bactérie diverses techniques dont la PCR intérêt : rapidité (1 journée) et sensibilité (sauf BK) pour la mise en évidence directement dans le prélèvement de bactéries à croissance lente ou /et difficile (et de nombreux virus) quand des trousses sont disponibles dans la commerce

Relations entre le laboratoire et le service demandeur le service clinique doit fournir les renseignements utiles à la qualité de l ’analyse: éléments cliniques, traitements pouvant interférer dans l ’analyse, contexte épidémiologique … l’interprétation des résultats et l’élaboration de la stratégie thérapeutique doivent être faites après confrontation des résultats avec les données cliniques.

La sérologie (1) = mise en évidence d’anticorps dans le sang par formation de complexes antigène-anticorps, en utilisant des antigènes spécifiques du micro-organisme recherché diverses techniques de révélation des complexes:agglutination, fluorescence…

La sérologie (2) sang prélevé sur tube sec stérile résultats en 24-48 heures 2 prélèvements pour mettre en évidence la montée du taux des anticorps: un le plus tôt possible et l’autre environ 15 jours plus tard en bactériologie: réservé aux cas de diagnostic direct difficile (ex: brucellose, légionellose, mycoplasmes, chlamydia…) très utilisé en virologie et parasitologie

Bactéries et antibiotiques

Structure des bactéries Bactérie = Cellule procaryote Paroi Membrane cytoplasmique Cytoplasme Chromosome circulaire

Les antibiotiques Cible: les différentes voies métaboliques des bactéries

ANTIBIOTIQUES INTERVENANT DANS LA SYNTHESE DE LA PAROI -LACTAMINES GLYCOPEPTIDES FOSFOMYCINE BACITRACINE

Cible d’action des béta-lactamines

ANTIBIOTIQUES ACTIFS SUR LES MEMBRANES POLYMYXINES

ANTIBIOTIQUES INHIBANT LA SYNTHESE OU L'EXPRESSION DE L’ADN QUINOLONES RIFAMPICINE INHIBITEURS DE LA SYNTHÈSE DES FOLATES : SULFAMIDES ET TRIMETHOPRIME 5-NITRO-IMIDAZOLÉS NITROFURANES

ANTIBIOTIQUES INHIBANT LA SYNTHESE DES PROTEINES MACROLIDES ET APPARENTES TETRACYCLINES AMINOSIDES CHLORAMPHENICOL ACIDE FUSIDIQUE

Synthèse des protéines

Synthèse des protéines

Synthèse des protéines

Les champignons et les anti fongiques

Caractéristiques des champignons Cellules qui produisent de l’énergie (glycogène), se reproduisent (spores) Paroi rigide (polysaccharides) Membrane cytoplasmique (ergostérol) Noyau avec membrane nucléaire Cytoplasme avec des mitochondries

Les virus

Structure virale Un acide nucléique , ADN ou ARN Un complexe protéique protecteur, la capside Une enveloppe (membrane lipidique) facultative

La multiplication virale Virus = être très simple incapable de se multiplier seul Pas de matières premières Pas de sources d’énergie Pas d’enzymes Seulement l’information génétique → pour la réplication: utilisation de la machinerie de la cellule infectée

LA MULTIPLICATION DU VIRUS DANS LA CELLULE CIBLE A : Attachement B : Pénétration C : Décapsidation D : Réplication E : Synthèse des protéines virales (par traduction des ARNm viraux) F : Assemblage G : Libération des virions néoformés par bourgeonnement ou fusion-lyse

Les antiviraux Ne visent pas les virus eux-mêmes qui sont métaboliquement inertes Bloquent le cycle de multiplication des virus, à différentes étapes

PRINCIPAUX ANTIVIRAUX PÉNÉTRATION ET DÉCAPSIDATION T-20 ou pentafuside= FUZEON®  Produit actif sur le virus de l’immunodéficience humaine : inhibiteur de fusion Amantadine = (MANTADIX®) = Chlorhydrate d'amino-L-adamantane Action sur les virux grippaux (Influenzavirus A et B) Amantadine

incorporation au cours de la synthèse de l’acide nucléique viral RÉPLICATION incorporation au cours de la synthèse de l’acide nucléique viral 1. Inhibiteurs par compétition avec un nucléotide naturel ou par terminaison de chaîne = Analogues nucléosidiques (analogues de base ou de sucre de l’acide nucléique) ex: - aciclovir ou ZOVIRAX® (herpes virus) - ganciclovir ou CYMEVAN® (cytomégalovirus) - zidovudine (AZT) ou RETROVIR*® (Hiv) -lamivudine (3TC) ou EPIVIR®,….

2. Inhibiteurs non nucléosidiques d’enzyme virale Névirapine Névirapine (VIRAMUNE®) Efavirenz ou SUSTIVA®,…  Action sur le VIH

3. Incorporation directe à l’ADN viral Acide phosphonoformique (FOSCAVIR®) = PFA = foscarnet  Action sur les virus herpes simplex, varicelle-zona, cytomégalovirus…

inhibiteurs de protéases MATURATION inhibiteurs de protéases Nelfinavir ou VIRACEPT® Saquinavir ou INVIRASE  Action sur les virus de l’immunodéficience humaine

Inhibiteurs de la neuraminidase LIBÉRATION Inhibiteurs de la neuraminidase   4- guanidino-Neu5Ac2en = Zanamivir ou RELENZA®  Oseltamivir ou TAMIFLU®  Action sur les virus grippaux (Influenzavirus A et B) Zanamivir

Schéma de multiplication du VIH et cibles thérapeutiques

Les interférons Dégradation des ARN messagers par activation d’une ribonucléase → arrêt de la production des protéines virales