Travaux Pratiques ELISA Expérience pour rechercher une infection au VIH Démonstration de la présence d’anticorps anti-VIH dans le sang

Préparations par l’enseignant

1. Préparation des solutions tampons Tampon PBS (100 ml) 90 ml H2Odist. + 10 ml PBS (10x) Le tampon PBS est nécessaire à la solubilisation des antigènes et des anticorps hydrophiles. Tampon de lavage (900 ml) 805 ml H2Odist. + 90 ml PBS (10x) + 4,5 ml Tween 20 Le tampon de lavage est nécessaire pour diluer la solution d'anticorps et pour laver les plaques de microtitrage. Le Tween 20 contient de la SAB pour bloquer la surface plastique libre.

! 2. Réhydratation Ouvrir les flacons d‘antigène et d‘anticorps Ajouter 0,5 mL de tampon PBS dans le flacon d‘antigène et dans les flacons des anticorps primaire et secondaire Fermer les flacons et agiter pendant environ 2 minutes (solutions mères) Toutes ces solutions mères sont concentrées 50 fois ! Elles seront diluées juste avant la manipulation

3. Etiquetage Etiqueter trois flacons en polyéthylene avec: antigène anticorps primaire anticorps secondaire Ils accueilleront les solutions diluées juste avant la manipulation

Préparations par les élèves 8 équipes

Vue d‘ensemble des tubes Couleur du tube Etiquette Contenu Quantité vert “AG“ antigène 800 µl orange “sAB“ Anticorps secondaire marron “SUB“ substrat violet “pAB“ Anticorps primaire 120 µl bleu “WB“ Tampon de lavage jaune - - Encore vide!

1. Preparation des échantillons P1 – P8 - Légender les 8 tubes jaunes avec le numéro de votre groupe - Introduire 60 µL d’anticorps primaire (pAB, résultat positif du test) ou 60 µL de tampon de lavage (WB, résultat négatif du test) dans chacun des 8 tubes jaunes! Notez votre démarche (P1 – P8 sont les échantillons de sérum) - Distribuer 1 tube à chacune des 8 équipes !

Vue d‘ensemble complète des tubes Couleur du tube Etiquette Contenu Quantité vert “AG“ antigène 800 µl orange “sAB“ Anticorps secondaire marron “SUB“ substrat violet “pAB“ Anticorps primaire 120 µl bleu “WB“ Tampon de lavage jaune “P1 – P8” Sérum sanguin, éch. 1 à 8 60 µl chacun 9

2. Réalisation du test

2.1 Fixation de l’antigène sur la microplaque de titration - Légender la microplaque selon l’image ci-dessous + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 - Introduire 50 µl de solution d’antigène (AG, tube vert) dans chacun des 12 puits - Incuber pendant 5 minutes

Détection des anticorps Principes de base Les antigènes se fixent à la phase solide

2.2 Lavage des microplaques de titration Tapotez les microplaques sur un papier absorbant Introduire 250 µl de tampon de lavage dans chaque puits Attention! Pendant le pipetage, ne pas renverser de solution de lavage dans les autres puits! Tapotez les microplaques sur un papier absorbant

Détection des anticorps Principes de base Les antigènes se fixent à la phase solide La surface plastique encore libre est bloquée

2.3 Préparation des contrôles et des échantillons pAb contrôle positif: introduire 50 µL d’anticorps primaire (pAB, tube violet) dans les 2 puits étiquetés “ + ” contrôle négatif: introduire 50 µL de tampon de lavage (WB, tube bleu) dans les 2 puits étiquetés “ - ” WB + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

2.3 Préparation des contrôles et des échantillons échantillons 1 – 8: introduire 50 µL “d’échantillons de sérums à tester” P1 – P8 (tubes jaunes) dans les 8 puits etiquetés correspondant Utiliser un nouveau cône de pipette pour chaque puit ! + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 Incuber 5 minutes

Détection des anticorps Principes de base Les antigènes se fixent à la phase solide La surface plastique encore libre est bloquée Les anticorps primaires éventuellement présents se fixent sur les antigènes

2.4 Lavage des microplaques (voir 2.2 ) vider + 250 µl WB vider

2.5 Ajout des anticorps secondaires Introduire 50 µL d’anticorps secondaire (sAB, tube orange) dans chacun des 12 puits Incuber 5 minutes

Détection des anticorps Principes de base Les antigènes se fixent à la phase solide La surface plastique encore libre est bloquée Les anticorps primaires éventuellement présents se fixent sur les antigènes Les anticorps secondaires (portant l‘enzyme) se fixent aux anticorps primaires éventuellement présents

2.6 Lavage des microplaques deux fois (voir 2.2 ) vider + 250 µl WB vider 21

2.7 Ajout du substrat Incuber 5 minutes Introduire 50 µL de substrat (SUB, tube marron) dans chacun des 12 puits Incuber 5 minutes

Détection des anticorps Principes de base Les antigènes se fixent à la phase solide La surface plastique encore libre est bloquée Les anticorps primaires éventuellement présents se fixent sur les antigènes Les anticorps secondaires (portant l‘enzyme) se fixent aux anticorps primaires éventuellement présents La preuve de l‘infection est faite par la coloration du puit

3. Résultats Les échantillons positifs sont colorés en bleu, les échantillons négatifs restent incolores (Valider les contrôles). Vérifiez vos résultats (P1 – P8) dans l’équipe! exemple: + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8