Control of Hoxd Genes’ Collinearity during Early Limb Development Basile Tarchini and Denis Duboule Developmental Cell - January, 2006

Introduction Les gènes hox Impliqués dans l’identité cellulaire le long de axe du corps Codent pour facteur transcription  régulateurs de gènes 4 complexes homologues de gènes hox (a, b, c et d)

Introduction Notion de colinéarité Extrémité 3’  plus tôt – structures antérieures Extrémité 5’  plus tard – structures postérieures Étude de hox d : développement précoce du bourgeon de membre

Introduction Expression selon 2 vagues d’activation 1er vague : phase précoce Mal caractérisée Gène hoxd 1-9  tout le bourgeon au stade E9 Gène hoxd 10-13  localisé vers partie postérieure Permet formation stylopode et zeugopode Sens d’expression Postérieur Antérieur

Introduction Expression selon 2 vagues d’activation 2nd vague Gènes hoxd 10-13 uniquement  localisés dans partie distale Permet formation autopode Présence d’un enhancer en 5’ Sens d’expression Distal

Délétions et duplications dans cluster hoxd (Fig. 1) Insertion d’un site Lox / lignée Recombinaison méthode Cre-Lox par croisement

Obtention de lignée avec délétion ou duplication

On aura différentes souches Délétions de gènes internes Délétions des gènes en 5’ du cluster Duplications de gènes internes

Objectifs de l’article Quels sont les mécanismes régulateurs de la colinéarité spatiale et temporelle des gènes hoxd dans le développement précoce du bourgeon du membre supérieur de la souris ?

Résultats Matériels et méthodes Utilisation d’embryons de souris à différents stades de développement Hybridation in situ des embryons avec des sondes ARN des différents transcrits des gènes hoxd Comparaison d’un mutant avec un individu WT de la même portée

Effet des délétions internes sur la colinéarité temporelle (Fig. 2 A-I) Embryons stade 9-9,5 j Les gènes observés sont directement en 5’ de la délétion Expression des gènes uniquement dans les mutants au stade 9-9,5j  Expression précoce des gènes hoxd observés dans les individus possédant une délétion

Les gènes observés ne sont pas directement en 5’ de la délétion Expression précoce des gènes hoxd 10, hoxd 11, hoxd 13 Même résultats à un stade plus précoce avant la formation du bourgeon  Les délétions et donc le rapprochement des gènes vers la partie 3’ du cluster entraînent un timing d’expression plus précoce de ces gènes

Effet des délétions internes sur la colinéarité spatiale (Fig. 2 J-O) Ant post Observation des limb bud à 10,2-10,7 jours Expression des gènes dans une partie plus antérieure chez les mutants que chez les WT  Les délétions et donc le rapprochement des gènes vers la partie 3’ du cluster entraînent une antériorisation de leur profil d’expression

 Expression retardée des gènes en amont de la duplication Effet des duplications sur les colinéarités spatiale et temporelle (Fig. 3)  Observation de l’expression des gènes hoxd 10, 11, 12 à différents stades embryonnaires Embryon à 10j  Pas ou peu d’expressions des gènes hoxd 11 et 12 chez les mutants à 10 jours  Expression retardée des gènes en amont de la duplication

Embryon à 11j  Expression des gènes anormalement restreinte dans la partie postérieure  Postériorisation du profil d’expression des gènes en amont de la duplication

 Même observation avec une plus petite duplication Embryon à 9,5j  Même observation avec une plus petite duplication  Les spécificités spatiale et temporelle d’activation pendant la phase précoce de croissance du bourgeon du membre antérieur sont probablement déterminées par la position relative d’un gène hoxd à l’intérieur du cluster

 Il existe donc un élément régulateur en 3’ du cluster  Une activation précoce (plus près du 3’)  antériorisation du profil d’expression Une activation tardive (plus loin du 3’)  Postériorisation du profil d’expression  Il existe donc un élément régulateur en 3’ du cluster  L’activation progressive des gène de 3’ en 5’ est fonction de la distance relative des gènes par rapport à cet élément

Est-ce que la deuxième vague d’expression est touchée? Embryon à 12j Toujours postériorisation de l’expression (zeugopode) 2e vague d’expression non modifiée (autopode)  La modification dans le délai d’activation des gènes et dans leur localisation est maintenu au cours de la croissance  Les mécanismes de régulation de la deuxième vague sont indépendants de ceux de la première vague

Un élément en 5’ restreint l’expression à la partie postérieure Effet des délétions en 5’ sur la colinéarité spatiale et temporelle (Fig. 4) Puisque l’expression commence en 3’, si on lève les gène en 5’ on ne devrait voir aucun changement par rapport au WT mais… Embryon à 10,5j Postérieur Antérieur Postériorisation de l’expression quand gène est proche du 5’ du cluster Un élément en 5’ restreint l’expression à la partie postérieure

Absence de promoteurs spécifiques dans ce processus de régulation Embryon à 12j Postérieur Antérieur Postériorisation de l’expression Expression des gènes hoxd 4, 8 et 9 dans l’autopode Les gènes considérés comme étant en 3’ du cluster adoptent la régulation des gènes situés en 5’ c’est-à-dire la régulation de la 2nd vague (Si ils ont la localisation appropriée) Absence de promoteurs spécifiques dans ce processus de régulation

Evx2 soumis à la même colinéarité d’expression Evx2 est sous le même contrôle que la deuxième vague Expression prématurée Embryon à 9,2j Expression précoce (normalement en même temps que 2nd vague i.e. 10-11 jour) Postériorisation 10,5j Antérieur Postérieur Evx2 soumis à la même colinéarité d’expression 12j

Conclusion 2 vagues d’activation des gènes hoxd sont nécessaires pour le développement complet du membre Existence d’un régulateur en 3’ responsable de la colinéarité temporelle Existence d’un régulateur en 5’ responsable de la colinéarité spatiale (restriction) Régulateur en 5’ activateur de la 2e vague (5 derniers gènes du cluster) différent de celui de la 1e vague

 Formation de la partie proximale du membre Conclusion Colinéarité temporelle : contrôlée par ELCR (early limb control region) en 3’ Colinéarité spatiale : Contrôlée par POST qui induit une inhibition de l’expression antérieure des gènes le plus en 5’ du cluster candidate Gli 3  Formation de la partie proximale du membre

2e vague permet la formation des parties distales (doigts) Régulateur en 5’ GCR : active les gène de la 2e vague à 10,5j (hoxd9-13 et evx2) Ce régulateur est non spécifique de ces gènes (active les 5 derniers du cluster (figure4) 2e vague permet la formation des parties distales (doigts)

Discussion La 1e vague  expression de SHH dans la partie postérieure du bourgeon SHH 2e vague d’expression des gène hoxd L’expression asymétrique des gènes hoxd 10-13  Asymétrie du membre final Présence de deux vagues pour former les parties distales et proximales  origines phylogénétiques différentes Mécanismes applicables aux membres postérieurs Peut être également généralisé à tous les vertébrés ayant des membres