Principes des vecteurs non réplicatifs Virus défectifs Un ou plusieurs gènes essentiels à la réplication sont délétés afin de rendre les virus incompétents pour toute réplication dans l’hôte. «  Packaging cell line » Une lignée cellulaire exprimant les gènes essentiels délétés dans le vecteur est construite afin de produire les vecteurs viraux. Séquences essentielles aux vecteurs Séquence  : séquence d ’encapsidation du vecteur recombinant Séquence poly A : séquence permettant la stabilisation des ARNm Séquences promotrices : Promoteur adapté en amont du TG Transgène

Réplication des rétrovirus LTR  pol env gag Bourgeonnement Fixation et entrée Noyau Cytoplasme Décapsidation Rétrotranscription Intégration Transport au noyau

Vecteurs rétroviraux Particularités des rétrovirus Virus enveloppés  pseudotype HIV/VSV env (ou autre protéines d ’enveloppe) Leur génome est un ARN + de taille réduite (10kb)  limitation de la taille des inserts Ils intègrent leur matériel génétique de manière aléatoire  risque de transformation Ils infectent largement les cellules mammifères Les lentivirus infectent les cellules quiescentes

Principe de fonctionnement des vecteurs rétroviraux (1) 

Principe de fonctionnement des vecteurs rétroviraux (2) LTR Transgène 

Principe de fonctionnement des vecteurs rétroviraux (3)

Vecteurs lentiviraux (HIV)

Vecteurs rétroviraux commerciaux

Avantages et limitations des vecteurs rétroviraux et lentiviraux Tropisme : large choix de protéines d ’enveloppe Pas de réplication autonome et production minimum de protéines virales chez l’hôte Réponse immunitaire très limitée Intégration aléatoire et persistance du DNA rétrotranscrit (sauf méthylation des promoteurs) Survie des cellules infectées Grand choix de promoteurs possibles Risque de recombinaison limité par le fractionnement des constructions Les vecteurs lentiviraux transduisent des cellules quiescentes Inconvénients Production difficile de hauts titres infectieux Intégration aléatoire, risque pathogène Insert de petite taille (max 10 kb) « Packaging cell lines » : constructions complexes exprimant gag, pol et env Les vecteurs rétroviraux classiques ne transduisent pas les cellules quiescentes

Vecteurs alphaviraux (SFV) Réplicases Protéines de structure  Virus à ARN+ simple brin Matériel génétique de petite taille (10kb) Virus enveloppés Entrée dans la cellule, via des récepteurs spécifiques Ils infectent tous les systèmes eucaryotes dont les cellules mammifères

Cycle des alphaviraux (SFV)

Vecteurs alphaviraux (SFV)  T7 1.Transcription in vitro (T7 polymérase) ARNm  3.Co-transfection 2. Clonage des protéines de structures et mutagénèse du site de clivage de la protéine d’enveloppe par un site sensible à la chymotrypsine 4.Traitement à la chymotrypsine

Avantages et limitations des vecteurs alphaviraux Facilité de constructions et d’études de nombreux mutants Tropisme : infecte tous les types cellulaires eucaryotes Choix possible des protéines d’enveloppe (mutagénèse du site de clivage/sécurité) Pas de réplication autonome Survie des cellules infectées Choix de promoteurs possibles Idéale pour la vaccination Inconvénients Difficulté de production des ARNm en grande quantité industrielle Production difficile de hauts titres infectieux Pas d ’intégration, expression transitoire Insert de petite taille (max 10 kb) « Packaging cells lines » : exprimant les protéines de structure Production des réplicases virales chez l’hôte Non déterminé Réponse immunitaire ? Infection des cellules quiescentes?

Vecteurs adénoviraux (Ad2, Ad5) Virus non enveloppés génome ADN 2 brins linéaires 36kb infectent les cellules quiecentes tropisme large (récepteur aux intégrines avb5 et avb3 ) niveau d’expression élevée

Infection par les adénovirus

Cycle viral des adénovirus

Organisation génétique des adénovirus  E1A : transactivation et entrée en phase S E1B : fonction anti-apoptotique E2 : réplication du DNA E3 : contrecarre les défenses innées E4 : régule le processing et l’export des ARNm tardifs IVa2 : transactivation du promoteur tardif

Première génération de vecteurs adénoviraux

Formation de virus recombinants Particularité des protéines E1 et E3 : E1 transactive l ’expression des gènes viraux et transforme les cellules E3 une protéine non essentielle qui contrecarre les défenses de l’hôte anti-adénovirus  la délétion de E1 et E3 libère 7kb pour insérer un transgène Séquences de recombinaison homologue (E2) ITR Transgène Génome viral 3’   Poly A MCS Transfection ITR Recombinaison homologue Noyau Cellules 293 (expriment E1) Adénovirus recombinant Promoteur

Vecteurs adénoviraux commerciaux

Vecteurs adénoviraux commerciaux

Deuxième génération de vecteurs adénoviraux

Avantages et limitations des vecteurs adénoviraux Tropisme pour des récepteurs largement exprimés (sauf lignées lymphoïdes) Pas de réplication autonome et production minimum de protéines virales chez l’hôte Survie des cellules infectées Choix de promoteurs, niveau d ’expression élevé Production de hauts titres infectieux Vecteur transduisant des cellules quiescentes « Packaging cell lines » : les cellules 293 expriment les protéines E1 Inconvénients Pas de choix possible des récepteurs La réponse immunitaire reste un obstacle majeur (80% de la population est séropositive) L ’ADN ne s ’intègre pas (épisome)  persistance limitée dans le temps du DNA (2 semaines) Insert de petite taille (max 7 kb) Risque de recombinaison théorique avec des infections endogènes

Vecteurs adéno-associés Utilisation principale : expression de protéines en cellules mammifères à des fins de thérapie génique (cellules quiescentes) Cycle réplicatif Virus nus ADN simple-brin linéaire (5 kb) Leur cycle réplicatif implique : L ’entrée dans la cellule par endocytose, via les héparines sulfates et récepteurs secondaires (avb5, FGF) (large spectre de cellules infectées) Adressage de l ’ADN au noyau Transcription en ADN double-brin (nécessite un virus helper du type adéno (E4), herpes) Intégration dans le chromosome 19 Expression des ARNm (facilitée par les virus  helper ) La production de particules virales (très résistantes : pH, température, détergents) Ils infectent la plupart des cellules mammifères

Formation de virus recombinants Particularité des vecteurs adéno-associés : Tous les gènes viraux sont délétés Les « packaging cell lines » sont complémentés pour les protéines virales et helper Gènes rep Gènes cap  Transgène Poly A Plasmide E2 et E4 adénovirus   MCS Transfection ITR ITR Noyau Cellules 293 (expriment E1) Virus adéno-associé recombinant Promoteur

Avantages et limitations des vecteurs adéno-associés Tropisme pour un récepteur largement exprimé Pas de réplication autonome et absence de production de protéines virales par l’hôte Survie des cellules infectées Production de hauts titres infectieux L ’ADN s ’intègre dans le chromosome 19  persistance de l ’expression  intégration aléatoire limitée Réponse immunitaire très faible Les vecteurs transduisent des cellules quiescentes Inconvénients Pas de choix possible des récepteurs Insert de petite taille (max 4 kb) « Packaging cell lines » : expriment rep, cap (adéno-associées) E1, E3 et E4 (adénovirus)

Stratégies d’utilisation des alphavirus Poly A  5’ SP6 ou T7 3’ réplicases Pro Transgène Transcription in vitro (SP6 ou T7 polymérase) * ARNm Transfection * Possibilité de transfecter l’ADN sous le contrôle d ’un promoteur eucaryote Packaging cell line exprimant les protéines de structures Noyau SFV recombinant