Journal of Bacteriology (2009) ‘’Docking and Assembly of the Type II Secretion Complex of Vibrio cholerae’’ Journal of Bacteriology (2009) Lybarger et al Bressuire Christelle

Le Système de sécrétion de type II INTRODUCTION Le Système de sécrétion de type II - Mécanisme en 2 étapes Translocation MI via Sec ou Tat Machinerie complexe similaire machinerie d’assemblage Pili type IV Translocation ME de la conformation repliée

Vibrio cholerae INTRODUCTION Bacille incurvé Gram – Responsable du cholera Sécrétion de toxine et de facteurs de virulence par SST2

Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae INTRODUCTION Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae

Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae INTRODUCTION Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae

Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae INTRODUCTION Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae

Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae INTRODUCTION Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae Comment s’assemble le SST2 dans la paroi de Vibrio cholerae ?

Interactions protéine-protéine du SST2 INTRODUCTION Interactions protéine-protéine du SST2 C Assemblage du SST2 ? Etude interactions protéine-protéine

Interactions protéine-protéine du SST2 INTRODUCTION Interactions protéine-protéine du SST2 C Assemblage du SST2 ? Etude interactions protéine-protéine GspC GspD

Interactions protéine-protéine du SST2 INTRODUCTION Interactions protéine-protéine du SST2 C Assemblage du SST2 ? Etude interactions protéine-protéine GspC GspD Gsp C GspM et GspL

Interactions protéine-protéine du SST2 INTRODUCTION Interactions protéine-protéine du SST2 C Assemblage du SST2 ? Etude interactions protéine-protéine GspC GspD EpsL EpsM Gsp C GspM et GspL

Interactions protéine-protéine du SST2 INTRODUCTION Interactions protéine-protéine du SST2 C Etude de l’assemblage du SST2 de Vibrio cholerae Etude des interactions protéine-protéine de EpsC et EpsM Suivit des protéines GFP-EpsC et GFP-EpsM in vivo Protéine GFP (Green Fluorescent Protein)

Localisation polaire de GFP-EpsM Directed polar secretion of protease from single cells of Vibrio cholerae via the type II secretion Pathway. Scott et al. PNAS (2001) Green fluorescent chimeras indicate nonpolar localization of pullulanase secreton components PulL and PulM. Buddelmeijer et al. J. Bacteriol (2006) GFP-EpsM localisé aux pôles de la bactérie Vibrio cholerae GFP-PulM non surproduit n’est pas localisé aux pôles de la bactérie Klebsiella Oxytoca

Localisation polaire de GFP-EpsM Directed polar secretion of protease from single cells of Vibrio cholerae via the type II secretion Pathway. Scott et al. PNAS (2001) Green fluorescent chimeras indicate nonpolar localization of pullulanase secreton components PulL and PulM. Buddelmeijer et al. J. Bacteriol (2006) GFP-EpsM localisé aux pôles de la bactérie Vibrio cholerae GFP-PulM non surproduit n’est pas localisé aux pôles de la bactérie Klebsiella Oxytoca La localisation polaire de GFP-EpsM est-elle due à la surproduction de la protéine?

Localisation de GFP-EpsM ? Souche Vibrio cholerae ∆epsM + pGfp-EpsM

Localisation de GFP-EpsM ? Observation au microscope à fluorescence C Induction à l’IPTG Localisation des protéines GFP-EpsM aux pôles de la bactérie

Localisation de GFP-EpsM ? Observation au microscope à fluorescence C Sans induction à l’IPTG Localisation des protéines GFP-EpsM à la périphérie de la membrane

Localisation de GFP-EpsM ? Observation au microscope à fluorescence + IPTG - IPTG La Localisation polaire de GFP-EpsM est due à l’induction à l’IPTG

Localisation de GFP-EpsM ? Observation au microscope à fluorescence + IPTG - IPTG Artefact !!! La Localisation polaire de GFP-EpsM est due à la surproduction de la protéine.

Localisation polaire de GFP-EpsM= Surproduction protéines? Surproduction des protéines GFP-EpsM les protéines GFP-EpsM sont localiseés aux pôles de la bactérie Hypothèse 1: la surproduction des protéines GFP-EpsM Hypothèse 2: les protéines GFP-EpsM sont surproduites alors que les autres protéines du SST2 ne le sont pas

Souche Vibrio cholerae Gfp-EpsM Hypothèse 1 ou 2? Souche Vibrio cholerae Gfp-EpsM

Souche Vibrio cholerae Gfp-EpsM Hypothèse 1 ou 2? C C Souche Vibrio cholerae ∆epsM + pGfp-EpsM Souche Vibrio cholerae Gfp-EpsM Promoteur Inductible = Protéine GFP-EpsM peut être produite à un niveau différent de celui des autres protéine Eps Promoteur eps = Protéine GFP-EpsM produite en adéquation avec les autres protéines Eps

Protéine GFP-Eps = Protéine native Eps? C ? Localisation protéines GFP-EpsC et GFP-EpsM Localisation protéine native EpsC ou EpsM ? SST2 assure la sécrétion des toxines de Vibrio cholerae

Vérification production protéine de fusion par Western-Blot Détection protéine GFP-EpsM Protéine GFP –EpsM instable ? ‘’Cross reactive band’’ ? Détection de protéine GFP-EpsC

Le SST2 des souches GFP-EpsC et GFP-EpsM est il toujours fonctionnelle ? Induction IPTG protéaseVC1200 Methylcoumarin fluorescent BOC

L’insertion de la fusion GFP n’empêche pas le Le SST2 des souches GFP-EpsC et GFP-EpsM est il toujours fonctionnelle ? L’insertion de la fusion GFP n’empêche pas le fonctionnement du SST2

Localisation des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM Observation au microscope à fluorescence Protéine de fusion localisé dans la membrane de Vibrio cholerae et non aux pôles

Localisation polaire de GFP-EpsM= Surproduction protéines? Surproduction des protéines GFP-EpsM les protéines GFP-EpsM sont localisés aux pôles de la bactérie Hypothèse 1: la surproduction des protéines GFP-EpsM Hypothèse 2: les protéines GFP-EpsM sont surproduit alors que les autres protéines du SST2 ne le sont pas

Localisation polaire de GFP-EpsM= Surproduction protéines? Surproduction des protéines GFP-EpsM les protéines GFP-EpsM sont localisés aux pôles de la bactérie Hypothèse 1: la surproduction des protéines GFP-EpsM Hypothèse 2: les protéines GFP-EpsM sont surproduit alors que les autres protéines du SST2 ne le sont pas La stœchiométrie des protéines de fusion et des autre Eps est nécessaire à la localisation des protéines de fusions

Localisation des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM Observation au microscope à fluorescence ? Points de fluorescence= SST2 assemblé

Point de fluorescence = SST2 assemblé? Observation au microscope à fluorescence C Dispersion de la fluorescence Compétition Protéine native Eps / Protéine GFP-Eps Point de fluorescence = SST2 assemblé

Vérification de l’importance du maintien de la stœchiométrie des Eps pour la localisation des protéines C Souche Vibrio cholerae PBAD Remplacement epsC et epsM par leur version fusionnée gfp-epsM et gfp-epsC sous le contrôle du promoteur pbad inductible à l’arabinose. Maintien équilibre des éléments Eps du T2SS

Vérification de l’importance du maintien de la stœchiométrie des Eps pour la localisation des protéines

Pré requis pour détermination de la localisation cellulaire Vérification de l’importance du maintien de la stœchiométrie des Eps pour la localisation des protéines Maintien de la stœchiométrie naturelle de chacun des composants du SST2 = Pré requis pour détermination de la localisation cellulaire

Observation au microscope à fluorescence

Observation au microscope à fluorescence Le nombre de point de fluorescence augmente avec le niveau d’induction à l’arabinose

Corrélation Points de fluorescence/Sécrétion protéase du SST2?

Corrélation Points de fluorescence/Sécrétion protéase du SST2? Les points de fluorescence représentent un SST2 fonctionnelle

Localisation protéine GFP-EpsC et Eps= Localisation protéine native EpsC et EpsM ? Localisation protéine EpsG par immunofluorescence

Points de fluorescence Localisation protéine GFP-EpsC et Eps= Localisation protéine native EpsC et EpsM ? Auto-fluorescence Points de fluorescence

Points de fluorescence Localisation protéine GFP-EpsC et Eps= Localisation protéine native EpsC et EpsM ? Auto-fluorescence Points de fluorescence la localisation des protéines de fusion est représentatif des protéines natives

du Système de sécrétion de type II Assemblage du Système de sécrétion de type II

MreB n’est pas nécessaire à l’apparition des points de fluorescence Ancrage du système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae Rôle filaments cytosquelette MreB ? MreB n’est pas nécessaire à l’apparition des points de fluorescence

MreB n’intervient pas dans l’arrimage du SST2 Ancrage du système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae Rôle filaments cytosquelette MreB ? MreB n’est pas nécessaire à l’apparition des points de fluorescence L’activité du SST2 ne dépend pas de MreB MreB n’intervient pas dans l’arrimage du SST2

Interactions protéine-protéine entre GFP-Eps et les autres Eps Rôle des autres protéines Eps dans la localisation de EpsC et EpsM? C Délétions des autres gènes Eps Observation de l’effet de la délétion: Sur l’expression des gènes gfp-EpsC et gfp-EpsM Sur l’activité du SST2 Sur la localisation des protéines de fusion GFP-EpsC et GfP-EpsM

Effet de la délétion des gènes epsD, espL et epsM ? Sur le niveau d’expression?

Effet de la délétion des gènes epsD, espL et epsM ? Sur le niveau d’expression? La délétion d’epsD espL et epsM entraine une surproduction des autres protéines Eps

Effet de la délétion des gènes epsD, espL et epsM ? Sur le niveau d’expression? C Augmentation de la production des protéines Eps non due à la fusion GFP Hypothèse: Absence Eps D, EpsL ou EpsM SST2 non fonctionnelle Suractivation du promoteur eps (facteur σE) Augmentation de la production des autres protéines Eps

Effet de la délétion des gènes epsD, espL et epsM ? Sur l’activité du SST2?

Effet de la délétion des gènes epsD, espL et epsM ? Sur l’activité du SST2? La Délétion des gènes epsD, espL et epsM empêche la sécrétion de protéase par le SST2

Dispersion de la fluorescence Effet de la délétion des gènes epsD? Sur la localisation de EpsC? Dispersion de la fluorescence

Dispersion de la fluorescence Effet de la délétion des gènes epsD? Sur la localisation de EpsC? Dispersion de la fluorescence La localisation de EpsC semblerait dépendre d’EpsD

Dispersion de fluorescence= Surproduction protéine GFP-EpsC suite à la délétion d’epsD? Souche Vibrio cholerae PBAD::gfp-espC Délétion epsD gfp-epsC sous le contrôle du promoteur eps inductible à l’arabinose Empêche la surproduction des protéines EpsC due à la délétion d’epsD

Dispersion de la fluorescence Dispersion de fluorescence= Surproduction protéine GFP-EpsC suite à la délétion d’epsD? Dispersion de la fluorescence

Dispersion de la fluorescence Dispersion de fluorescence= Surproduction protéine GFP-EpsC suite à la délétion d’epsD? Dispersion de la fluorescence EpsD à un rôle crucial dans la localisation de EpsC

Effet de la délétion des gènes epsL et epsM? Sur la localisation de EpsC? Délétions n’empêchent pas la formation des points de fluorescence Plus de points de fluorescence aux pôles des cellules

Effet de la délétion des gènes epsL et epsM? Sur la localisation de EpsC? Délétions n’empêchent pas la formation des points de fluorescence Plus de points de fluorescence aux pôles des cellules EpsM et EpsC sembleraient maintenir EpsC au niveau de la membrane latérale

Interactions EpsL et EpsM Moins de protéine EpsL en absence d’ EpsM et inversement Effet accrue en phase stationnaire due au nombreuses protéases

Interactions EpsL et EpsM Moins de protéine EpsL en absence d’ EpsM et inversement Effet accrue en phase stationnaire due au nombreuses protéases Effet de protection mutuelle dans l’interaction EpsL/EpsM

Effet de la phase stationnaire sur la localisation de GFP-EpsC Cellules plus courtes mais même points de fluorescence Localisation de GFP-EpsC aux pôles de la cellules et dans le cytoplasme

Effet de la phase stationnaire sur la localisation de GFP-EpsC Restauration des points de fluorescence après complémentions des gènes epsL et epsM délétés Hypothèse: EpsC est sujet à la protéolyse en l’absence d’EpsM et EpsL EpsL-EpsM stabilisent EpsC dans une conformation nécessaire à sa localisation dans la membrane latérale

Dispersion de la fluorescence Effet de la délétion des gènes epsD? Sur la localisation de EpsM? Dispersion de la fluorescence

EpsD est nécessaire à la localisation d’EpsM Effet de la délétion des gènes epsD? Sur la localisation de EpsM? Dispersion de la fluorescence EpsD est nécessaire à la localisation d’EpsM

Effet de la délétion des gènes epsL et epsC? Sur la localisation de EpsM? Dispersion de la fluorescence Restauration des points de fluorescence par complémentation

EpsC et EpsL sont nécessaire à la localisation d’EpsM Effet de la délétion des gènes epsL et epsC? Sur la localisation de EpsM? Dispersion de la fluorescence Restauration des points de fluorescence par complémentation EpsC et EpsL sont nécessaire à la localisation d’EpsM

Co-localisation de mCherry-EpsC and GFP-EpsM? Points jaunes = SST2 assemblé ?

Conclusion Localisation non polaire du SST2 mais tout au long de la membrane = artefact due à la surproduction des protéines Eps. Importance du respect de la stœchiométrie naturelle des éléments du SST2 pour l’observation de leur localisation. Technique de fusion des protéines Eps au GFP permet l’étude des interactions directement au sein du SST2. Relations entre les Eps mise en évidence: EpsD est nécessaire à la localisation d’EpsC EpsM/EpsL assurent le maintien d’EpsC à la membrane latérale EpsD, EpsC et EpsL permettent la localisation d’EpsM Modèle de l’assemblage du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae

Modèle de l’assemblage du SST2

Modèle de l’assemblage du SST2

Modèle de l’assemblage du SST2

Modèle de l’assemblage du SST2

Merci pour votre attention