Le clonage
Les enzymes de restriction
X-gal: sélection bleu-blanc
La production d’une molécule recombinante
La production des molécules recombinantes-suite -ligation avec l’ADN coupé avec un seul enzymepeut donner très peu de recombinantes -le rapport plasmide/insert est capital -traitement avec une phosphataseplus de recombinantes -couper les molécules d’ADN avec 2 enzymesplus de recombinantes -la température de la ligation: 20°C est mieux que 37°C -extrémités franches-ligation plus difficile: réduit la température et augmente le temp de ligation
Digestion avec 2 enzymes 5’-----AAGCTT------------GAATTC---------3’ 3’-----TTCGAA------------CTTAAG---------5’ Plasmide avec une site HindIII et une site EcoR1 Digestion avec les deux enzymes…… 5’-----A AATTC--------3’ 3’-----TTCGA G--------5’ Une ligase ne peut pas mettre ces deux extrémités ensemble manque de compatibilité des nucléotides
La transformation des bactéries -phase exponentiel -en présence de Ca++ à 4°C -choque thermique
Gel d’agarose
TP de clonage Premier jour -digestion de l’ADN de la bactériophage lambda et l’ADN de pBS avec des enzymes Hind III et Eco R1 -inactivation des enzymes de restriction à 70°C -ligation des produits de la digestion -électrophorèse des produits de la digestion sur gel d’agarose -transformation des bactéries compétentes -étalage des bactéries sur les boîtes de petri amp/x-gal Deuxième jour -préparation des plasmides recombinantes -digestion de l’ADN des plasmides -électrophorèse des produits de la digestion -identification des fragments de l’ADN de la phage lambda clonés dans le plasmide