Technologies et biotechnologies végétales Marie-Françoise Niogret Antoine Gravot UMR 6026 Interactions Cellulaires et Moléculaires S7 : Technologie et biotechnologie végétales

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies « Transformation de matière première en biens ou services par le moyen d’organismes vivants » Fermenteurs Bioréacteurs

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies « Technologies impliquant l’obtention et/ou l’utilisation d’organismes génétiquement modifiés »

Meristem Therapeutics Bretagne Biotechnologies Végétales S7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies « Technologies innovantes basées sur des connaissances scientifiques dans le domaine du vivant, impliquant d’importants investissements en R&D et une large ambition commerciale» Meristem Therapeutics Bretagne Biotechnologies Végétales

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies végétales « Développement et utilisation de techniques de cultures in vitro dans différents domaines relatifs au végétal et à l’amélioration variétale» www.srpv-bretagne.com Haplodiploïdisation Culture de méristèmes Micropropagation Sauvetage d’embryons Fusion de protoplastes Création de variabilité Banque de germoplasmes …

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies « Développement et application d’outils moléculaires dans différents domaines relatifs à l’agronomie et la médecine » Science Museum/Science & Society Picture Library

Définitions Issues du génie des procédés (école allemande) S7 : Technologie et biotechnologie végétales Définitions Issues du génie des procédés (école allemande) Définition historique (Karl Ereky), début XXème Production de biens à partir de matière première en utilisant des organismes vivants Utilisation des techniques de fermentation et dérivées Mots clés : génie des procédés, production industrielle Issues du génie génétique (école américaine) Depuis les années 70 « Utilisation des techniques de l’ADN recombinant » Mots clés : ADN recombinant, protéines hétérologues, organismes génétiquement modifiés Gerard Siclet : Technologies de pointe mettant en œuvre des processus cellulaires ou moléculaires, grâce au génie génétique Plaçant au premier plan les applications industrielles et commerciales Définition OCDE 1980 : Mise en œuvre de matériel biologique pour la production de biens et de services En Europe : définitions concernant spécifiquement le végétal et insistant soigneusement sur les technologies ne faisant pas appel à la transgenèse Plus récemment : définitions incluant les approches de génomique

Biotechnologies végétales : S7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies végétales : Domaines abordés dans ce cours : Ensemble de pratiques faisant appel aux cultures in vitro de plantes et aux techniques de biologie moléculaire dans les domaines de l’agronomie, l’industrie et la recherche fondamentale Recherche fondamentale Agronomie : Création variétale, Multiplication conforme, Identification variétale… Cultures in vitro Biologie moléculaire Industrie Production de composés ou de protéines d’intérêt alimentaire et non-alimentaire

Au programme… MF Niogret Les cultures in vitro S7 : Technologie et biotechnologie végétales Au programme… Les cultures in vitro Totipotence de la cellule végétale Techniques de base de culture in vitro Applications technologiques: micropropagation, sauvetage d’embryon, haplo/diploïdisation, fusion de protoplastes… Applications en recherche : signalisation, adressage de protéines, échanges d’ions et de métabolites Biotechnologie moléculaire Bases de la transgenèse des végétaux Applications en agriculture conventionnelle Applications dans la valorisation non alimentaire des productions végétales Production de protéines recombinantes Production de métabolites secondaires Phytoremédiation MF Niogret

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Les travaux pratiques Rôle des substances de croissance dans l’organogenèse et composition des milieux de culture Préparation et fusion de protoplastes Caractérisation et phénotypage de mutants d’Arabidopsis

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Les travaux dirigés Préparation d’un exposé concernant un domaine de la biotechnologie végétale Réalisation d’un dossier concernant un gène chez Arabidopsis thaliana Expression tissulaire, régulation, fonctions connues Brevets Démarche concrète d’obtention de mutants

Totipotence chez le végétal Signification et limites S7 : Technologie et biotechnologie végétales

Plan Quelques définitions S7 : Technologie et biotechnologie végétales Plan Quelques définitions Naissance et développement des cultures in vitro Applications et limites de la totipotence Mécanismes sous-jacents à la totipotence Signification biologique de la totipotence des cellules végétales

Quelques définitions Spécificité du végétal Chez les animaux S7 : Technologie et biotechnologie végétales Quelques définitions Chez les plantes, la totipotence peut se définir comme la propriété qu’ont certaines cellules de pouvoir régénérer un individu lorsqu’elles sont placées dans des conditions appropriées, en passant éventuellement par une étape de dédifférenciation Spécificité du végétal Chez les animaux Cellules totipotentes: cellules issues des premières division de l'oeuf fécondé capables de donner naissance à tous les types de cellules de l'organisme et les seules à permettre le développement complet d'un individu. Cellules pluripotentes : Capacité que possède une cellule de se différencier en environ 200 types cellulaires représentatifs de l’ensemble des tissus (cellules souches embryonnaires issues d’embryons de 5 à 7 jours) Cellules multipotentes : capables de donner naissance à plusieurs types cellulaires (les cellules souches myéloïdes de la moelle osseuse sont à l’origine des cellules sanguine)

Exemple : microbouturage du Saint Paulia S7 : Technologie et biotechnologie végétales Exemple : microbouturage du Saint Paulia 2 mois plus tard Source : http://www.didier-pol.net/1CLONES.html

Historique La totipotence comme fil conducteur de la naissance des biotechnologies végétales S7 : Technologie et biotechnologie végétales

Historique de la culture de tissus et d’organes de plantes S7 : Technologie et biotechnologie végétales Historique de la culture de tissus et d’organes de plantes Contexte théorique au début du XXème siècle: Théorie cellulaire (Schleiden et Schwann) Microbiologie et biochimie Comment étudier le comportement de cellules isolées ? Cultures en conditions stériles Caractérisation de substances de croissance

G. Haberlandt : le concept de totipotence de la cellule végétale S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques G. Haberlandt : le concept de totipotence de la cellule végétale Deux idées importantes : la culture de cellules isolées constituerait potentiellement un modèle de recherche maintient en vie de cellules isolées Pas de multiplication cellulaire on peut potentiellement régénérer une plante entière à partir d’une cellule isolée  totipotence Échec (mauvais choix d’explants, méconnaissance des substances de croissance) http://users.ugent.be/~pdebergh/his/his2az1.htm

Émergence des techniques de culture S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Émergence des techniques de culture Haberlandt (1902) : concept de totipotence White (1934) : culture in vitro de racines de tomates Gautheret (1935) : utilisation d’auxine pour cultiver du cambium de saule 1939 : 1ère culture indéfinie de cals de carotte https://www2.carolina.com La culture de tissus est possible en utilisant des substances de croissance et/ou des tissus méristématiques

Émergence des techniques de culture S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Émergence des techniques de culture Braun (1941) : travaux sur le crown gall Miller (1955) : cytokinines Murashige et Skoog : mise au point de milieux de culture efficaces contenant des cytokinines et des auxines Croissance in vitro des tumeurs sans ajout d’hormones

Confirmation des hypothèses d’Haberlandt S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Confirmation des hypothèses d’Haberlandt 1956 (Muir) suspensions cellulaires 1958 (Reinart et Stewart) Embryogenèse somatique chez la carotte

Confirmation des hypothèses de Haberlandt S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Confirmation des hypothèses de Haberlandt 1965 (Vasil et Hilderbrandt) Régénération d’un plant de tabac à partir d’une cellule unique 1971 (Nagata et Takabe) Régénération d’un plant entier à partir d’un protoplaste

Développements : des outils agronomiques S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Développements : des outils agronomiques 1965 (Morel) multiplication in vitro des orchidées 1972 (Sharp) : tomates haploïdes à partir de pollen 1973 : hybride issu d’une fusion de protoplastes

Développements : production de métabolites secondaires S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Développements : production de métabolites secondaires 1977 : culture de cellules de tabac dans un réacteur de 20 000 litres 1983 (Mitsui Petrochemical) : production industrielle de métabolites secondaires

Développements : la transgenèse S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Développements : la transgenèse Van Montaigu (1983) : tabac résistant à la kanamycine 1994 : Flavr Savr (Calgene, antisensage d’une polygalacturonase) 1996 : maïs transgénique commercialisé aux USA

Conclusions Problématique initiale : S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Conclusions Problématique initiale : recherche d’un modèle de cellules isolées démonstration de la totipotence des cellules végétales Identification du rôle des substances de croissance Mise au point de nombreuses techniques Transgénèse

La totipotence : applications et limites S7 : Technologie et biotechnologie végétales

Principales méthodes de micropropagation Culture de méristème Meristème Plantules Apex caulinaire Tige feuillée Enracinement Morphogenèse directe Caulogenèse directe Embryogenèse somatique directe Semences artificielles Morphogenèse indirecte Callogenèse cal Suspensions cellulaires Caulogenèse indirecte Embryogenèse somatique indirecte Explants divers (racines, tige, feuilles…) Nœud D’après Lindsey et Jones 1989

Des cellules plus ou moins totipotentes S7 : Technologie et biotechnologie végétales Des cellules plus ou moins totipotentes Les méristèmes : un réservoir de cellules totipotentes Les autres types cellulaires : une totipotence plus ou moins facile à exprimer Utilisation de substances de croissance exogènes Régénération directe Régénération en passant par un stade de cal Variabilité interspécifique

S7 : Technologie et biotechnologie végétales

Limites de la totipotence : impossibilité technique S7 : Technologie et biotechnologie végétales Limites de la totipotence : impossibilité technique Différentiation irréversible : xylème (!) En fonction de la méthode de préparation des protoplastes, récalcitrance à la régénération Pour beaucoup d’espèces d’intérêt agronomique, les protoplastes ne sont pas totipotents (récalcitrants) ex : Vitis vinifera

Limites de la totipotence : S7 : Technologie et biotechnologie végétales Limites de la totipotence : Variation somaclonale Les plantes régénérées présentent souvent des problèmes Perte de caractères chimériques Aneuploïdies , délétions chromosomiques Modification du caractère juvénile Impact sur la fertilité

Mécanismes sous-jacents à la totipotence Chez les cellules végétales S7 : Technologie et biotechnologie végétales

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Pourquoi les cellules végétales sont totipotentes : Arguments classiques Petit nombre de types cellulaires Seulement 3 ou 4 types d’organes fondamentaux (racine, tige, feuilles) dont les fleurs, vrilles, épines, fruits et tubercules sont des dérivés Grande plasticité génomique la croissance peut rester presque normale malgré de profonds remaniements chromosomiques

Etapes liées à la totipotence S7 : Technologie et biotechnologie végétales Etapes liées à la totipotence Etape 1 : Cellules différentiées : dédifférenciation nécessaire Cellules souches méristématiques Etape 2 : mise en route de l’activité mitotique  utilisation de substances de croissance Etape 3 : autonomie de la croissance tissulaire vis-à-vis des substances de croissance exogènes Enjeux scientifiques actuels: Comprendre les mécanismes de dédifférenciation Comprendre la nature des cellules souches

Comprendre les mécanismes de dédifférenciation S7 : Technologie et biotechnologie végétales Comprendre les mécanismes de dédifférenciation Modulation de l’expression génétique via des mécanismes épigénétiques Reconformation de la chromatine Modification des histones Méthylation de l’ADN

Comprendre la nature des cellules souches S7 : Technologie et biotechnologie végétales Comprendre la nature des cellules souches Notion de cellule souche en biologie végétale Notion de niche de cellule souche en biologie végétale

Signification de la totipotence Pourquoi les cellules de plantes sont-elles totipotentes ? S7 : Technologie et biotechnologie végétales

Signification de la totipotence S7 : Technologie et biotechnologie végétales F. Hallé : la totipotence est une spécificité des organismes autotrophes fixés On retrouve la totipotence des cellules chez les coraux quels sont les autres points communs coraux / plantes ?

Points communs coraux/plantes Signification de la totipotence S7 : Technologie et biotechnologie végétales Points communs coraux/plantes Croissance indéfinie Zones méristématiques Morphologie type « fractales » Autotrophie, faible flux énergétique Vie fixée Durée de vie potentiellement illimitée Squelette de nature excrémentielle

Signification de la totipotence S7 : Technologie et biotechnologie végétales Deux contraintes : maximisation de la surface dans l’espace croissance verticale Développement en axes ramifiés Autotrophie : Faible flux énergétique Lutte contre la croissance homothétique

Signification de la totipotence S7 : Technologie et biotechnologie végétales Deux contraintes : maximisation de la surface dans l’espace croissance verticale Développement en axes ramifiés Autotrophie : Faible flux énergétique Lutte contre la croissance homothétique

Signification de la totipotence S7 : Technologie et biotechnologie végétales Deux contraintes : maximisation de la surface dans l’espace croissance verticale Développement en axes ramifiés Autotrophie : Faible flux énergétique Lutte contre la croissance homothétique Développement indéfini à partir des méristèmes Totipotence des cellules méristématiques

Fonctions biologiques de la totipotence S7 : Technologie et biotechnologie végétales Fonctions biologiques de la totipotence Architecture adaptée à l’autotrophie Réactivité du développement dans un contexte de vie fixée Multiplication végétative