Projection de cellules vivantes par procédé laser Dispositif expérimental et modélisation LASER Ludovic Hallo Candice Mezel, Agnès Souquet, Jérôme Breil Journée de l’Institut de Physique Fondamentale 13 novembre 2008 1

Collaboration Dominique Descamps, Vladimir Tikhonchuk CELIA, Université Bordeaux 1, CNRS, CEA, France Fabien Guillemot, Reine Bareille INSERM U577 – Biomatériaux et Réparation Tissulaire Université Bordeaux 2, France Antoine Bourgeade, David Hébert CEA CESTA, Le Barp, France Pere Serra, Martí Duocastella Department of Applied Physics and Optics Universitat de Barcelona, Espagne John Lopez, Marc Faucon ALPHANOV Centre Technologique Optique et Lasers Université Bordeaux 1, France Olivier Saut Institut de Mathématiques de Bordeaux Université Bordeaux 1, France Publications: C. Mézel et al, PoP (2008)‏ E. Gamaly et al., Current Applied Physics (2008)‏ L. Hallo, Conference New Models and Hydrocodes for Shock Wave processes in Condensed Matter, (Lisbonne 2008)‏ L. Hallo et al., IFSA 07 L. Hallo et al., Phys. Rev. B 76, 024101 (2007) Journée IPF 13/11/2008 2

Introduction Ingénierie Tissulaire → Développer des substituts biologiques qui vont restaurer, maintenir ou améliorer la fonction des tissus BioPrinting → Utiliser des cellules et/ou des matériaux bioactifs comme blocs de construction pour fabriquer des produits thérapeutiques nouvelle génération à base de cellules et biomatériaux et des systèmes biologiques. Applications → Dépôt de cellules sur des prothèses → Préfonctionnalisation – Micropatterning de biomateriaux GIS Biomatériaux pour la santé U 577 – CELIA …

Procédé de transfert par laser : Laser Induced Forward Transfer (LIFT)‏ Dispositif expérimental : Laser impulsionnel Cible avec biomatériau Substrat receveur Cible 2 ou 3 couches : Support transparent à laser Couches de transferts Couche optionnelle absorbante LIFT modifié : MAPLE-DW ** AFA-LIFT *** & BioLP **** ** MAPLE-DW : Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation Direct Write *** AFA-LIFT : Absorbing Film-Assisted LIFT **** BioLP : Biological Laser Printing

Différents Régimes de Transfert Modèle proposé : Impulsion laser Film Liquide (eau)‏ Couche transparente Poche de vapeur Vapeur détendue éjecté Couche absorbante (ablateur)‏ Matière ablaté Régime sous-seuil Régime de contact Régime éjection

Processus élémentaires du LIFT Mécanismes d’éjection d’une bulle de liquide Cu sur Silice Plots de Cr 10 µm J. Bohandy et al. J. Appl. Phys. 63, 1158 (1988)‏ I. Zergioti et al. , Appl. Surf. Sci. 127-129, 601 (1998)‏

Processus élémentaires du LIFT Formation d’un jet Plots d’Aluminium D.A. Willis and V. Grosu , Appl. Phys. Lett. 86, 244103 (2005)‏ Journée IPF 13/11/2008

Approche Expérimentale But : Réaliser des Transferts de biomatériaux et de cellules dans les meilleures conditions Objectifs: Imprimer des matrices de transfert reproductibles Trouver les meilleurs paramètres optiques pour minimiser les dommages cellulaires Moyens : Laser Nd:YAG pompé par diode 1064 nm Durée de l’impulsion : 30 ns Fréquence : 5 kHz Fluence : 80 à 200 mJ/cm² Distance de transfert : 300 µm INSERM U577 ALPhANOV Laser Nd:YVO4 pompé par diode Fréquence : 20 kHz Fluence : 0.6 à 1 J/cm² Distance de transfert : 1 mm

RESULATS EXPERIMENTAUX TRANSFERT D’HYDROGEL Maîtrise de la taille des éjecta Résultats reproductibles Détermination des paramètres tels que : - la vitesse des scanners - la fluence laser - l’entrefer - l’épaisseur de la matrice d’hydrogel - … f = 5 kHz F = 134 mJ/cm²

TRANSFERT D’ ELEMENTS BIOLOGIQUES Transfert de peptide sur un Biomatériau Impression de [3H]-Lysine sur du PET préfonctionnalisé observée au beta-imager f = 20 kHz F = 1.3 J/cm² e= 800 µm

Transfert de cellules Cellules Endothéliales Impression sur une lame de verre de cellules endothéliales EA-hy 926 marquées au Dil-Ac-LDL observées au microscope optique f = 20 kHz F = 1.2 J/cm² e= 1 mm C = 2.106 cellules/lame + Les gouttes contiennent des cellules - Forte Fluence  Déformation des gouttes et éclaboussures

Compréhension des mécanismes, paramètres, physiques : Cellules Epithéliales → Résultats similaires aux cellules endothéliales Cellules Ostéoblastiques f = 5 kHz F = qq 100 mJ/cm² e= 300 µm Ostéoblastes MG63 marquées au test Live-Dead Pourquoi une telle mortalité cellulaire ? Plusieurs hypothèses : - Dommage cellulaire dû à une fluence trop élevée - Débris d’or nocif - Influence du type cellulaire Compréhension des mécanismes, paramètres, physiques : modélisation du CELIA

Modélisation en régime nanoseconde Substrat receveur Air Eau Silice Laser Couche d’or Hydrogel → Eau

Modèle physico-numérique Propagation de l’onde laser Conservation de la masse Quantité de mouvement Energie

Analyse des processus Chauffage homogène de la couche d’or ( = épaisseur de peau)‏ Hydrogel et Silice restent à température ambiante Dépôt d’énergie laser provoque un choc dans l’or qui se propage dans l’eau Les ondes de détente mettent en vitesse la couche d’eau  éjection !

Résultats nanosecondes, 1D Paramètres étudiés : Vitesse, pression, température, densité - en fonction du temps pour différentes mailles caractéristiques - en fonction de la position pour différents temps caractéristiques Simulation pour : - une impulsion de 30 ns FWHM - une fluence de 100 mJ/cm²

Résultats nano 2D et comparaison aux résultats de Marti Duocastella M. Duocastella et al. Appl. Phys. A, 93 (2), 453-456, 2008

Modélisation nanoseconde Processus de formation du jet (2D) 1.35 mus 13.85 mus 41 mus 26.35 mus

Modélisation nanoseconde Variation du flux laser (t=23.9 mus) Flux laser nominal 1.5 * Flux laser nominal Jet Bulle Liquide jet 2 * Flux laser nominal 4 * Flux laser nominal Jet Explosion De vapeur

Modélisation en régime femtoseconde - Plus d’ablateur, on tire dans l’hydrogel - mécanismes hydrodynamiques semblables, Ou même plus simples (temps acoustique >> temps laser)‏ Difficulté nouvelle : l’eau est transparente au visible ! Notion de gap pour créer des électrons libres… 20

Modélisation en régime femtoseconde Silice Eau = 2,2 g/cm3 Ugap = 9 eV Ionisation à 6 photons 6 = 9,8 10-70 s-1 (cm2/W)6 Ith = 26 TW/cm2 Pcr = 1.98 MW = 1 g/cm3 Ugap = 6,5 eV Ionisation à 4 photons 4 = 4.635 10-61 s-1 (cm2/W)4 Ith = 1,5 TW/cm2 Pcr = 1.87 MW La puissance nécessaire à l’ionisation est faible

Estimation de la puissance dans le plan focal Energie laser absorbée Paramètres 0 <  Longueur d’onde:  = 800 nm Energie: E = 30 nJ Durée  = 100 fs Waist: 0 = 0.3 m Longueur de Rayleigh = 0.35 m Puissance critique Surface focale Sfoc = π0RL= 0.33 m2 Ifoc = 90 TW/cm2, Pfoc ≈ 0.3 MW Ith = 26 TW/cm2 Un plasma est formé au sein de la matière (absorbant comme un métal) 22

Propagation laser et absorption Equations de Maxwell couplées à un modèle d’ionisation laser Équations de Maxwell Evolution de la densité et de l’énergie 23

Énergie laser absorbée  = 800 nm 0 = 0.3 m  = 100 fs Elaser = 50.5 nJ Emax = 1.1 1010 J/m3 Emax = 1.2 1010 J/m3 Elaser = 22.4 nJ Elaser = 5.6 nJ Emax = 5 109 J/m3 24

dépôt d’énergie Maxwell + ionisation (qq centaines de fs)‏ Simulations hydrodynamiques Conditions initiales : dépôt d’énergie Maxwell + ionisation (qq centaines de fs)‏ Code hydro 2D - 2 températures Ti, Te - Ionisation à l’équilibre - Equipartition électrons-ions Conduction thermique Grille mobile “Lagrangienne” Non structuré, ALE Equations d’Etats Tabulées (SESAME et Equations “maison”)‏ 25 25

Séquence hydrodynamique après le dépôt 500ps 1 m 5 ns  = 800 nm 0 = 0.3 m = 100 fs Elaser = 50.5 nJ Choc divergent, déformation de la face arrière Formation d’une « cavité » 7.5 ns 13.2 ns Rayon maximum de cavité Collapse de la cavité et formation d’un jet 26

Séquence de formation du jet hydrodynamique  = 800 nm 0 = 0.3 m = 100 fs Elaser = 50.5 nJ Pression Densité 27

Influence de la variation de l’énergie déposée Jet, et collapse Jet 1.5 El 2 El Processus essentiellement Hydrodynamique Faible sensibilité à une sur-énergie laser Jet

Influence de la position du recul de la zone de dépôt Depôt -1 mum Depôt -0.5 mum Collapse Jet Depôt initial Depôt +0.5 mum Jet Jet diphasique

Conclusion et perspectives LIFT : Premiers résultats expérimentaux nano « aquitains » Interprétation hydrodynamique en régime nanoseconde Comparaison expérimentale encourageante Analyse de la sensibilité du processus au paramètre flux laser Chaîne de calcul prédictive en cours de validation Comparaison à d’autres dispositifs (Or, Titane…) « NanoLift «: Premiers résultats de modélisation -> Nouveau La formation du jet est similaire au processus ns Bonne maîtrise de l’absorption nécessaire Bonne maîtrise de l’hydrodynamique indispensable (ALE, remaillage…) Nécessité de mise en place d’une démarche expérimentale