La Signalisation intracellulaire

Comment les cellules communiquent-elles ? Cellule cible Cellule sécrétrice Molécule de signalisation Récepteur Cellule sécrétrice Cellule cible Molécule de signalisation Récepteur

Les différents types de récepteurs Les récepteurs membranaires Récepteur membranaire de surface Molécule de signalisation hydrophile Les récepteurs intracellulaires Molécule de signalisation hydrophobe La plupart des molécules de signalisation sont des molécules hydrophiles qui par conséquent sont incapables de traverser la bicouche lipidique Cependant certains petites molécules hydrophobes peuvent traverser la membrane lipidique et se lier sur des récepteurs intracellulaires. La plupart de ces petites molécules sont pratiquement insolubles en milieu acqueux, c’est pourquoi elles sont transporter des le sang et dans les fluides extracellulaires par des protéines porteuses dont elles se dissocient pour pénétrer dans la cellule cible Protéines de transport Récepteur intracellulaire

Les différents formes de communications des molécules de signalisation sécrétées La communication paracrine Paracrine: les molécules de signalisation sont relarguées dans l’espace extracellulaire et agissent sur des cellules avoisinantes Synaptique: Cela a lieu dans les neurones qui transportent le signal électriquement le long de leur axone, et qui sécrétent des neurotransmetteurs au niveau de leur synapses, neurotransmetteurs qui vont agir sur le corps celluaire du neurone voisçin La communication synaptique

Les différents formes de communications des molécules de signalisation sécrétées La communication endocrine La communication autocrine

Comment la cellule répond elle à ces signaux ? Signaux extracellulaires Evoquer le fait que d’un cellule à l’autre un même stimulus n’induira pas forcément la même réponse. Cela dépend notamment du pool de récepteur présent à la surface de la cellule et de la machinerie intracellulaire Différenciation Apoptose Prolifération

Les différents types de récepteurs membranaires Les récepteurs ionotropiques Canal ionique Les récepteurs couplées aux protéines G Enzyme activée enzyme protéine G Le récepteur ionotrope est majoritairement retrouvé au niveau de synapses Parler dans les récepteurs à activité enzymatique des deux catégories : ceux qui ont une activité intrinsèque comme le montre le schéma et ceux qui sont associées à une protéine porteuse de cette activité enzymatique Les récepteurs avec une activité enzymatique Domaine catalytique actif Domaine catalytique inactif

Les récepteurs à activité enzymatique intrinsèque Différentes activités enzymatiques intrinsèques ont été mise en évidence : Activité tyrosine kinase (PTK) Ex : le récepteur au PDGF, à l’EGF ou les récepteurs aux cytokines Activité sérine/thréonine kinase Ex : le récepteur au TGF Activité tyrosine phosphatase (PTPase) Ex : CD45 Activité guanylate cyclase Ex : Récepteur à l’ANF (Atrial Natriuretic factor) C’est l’un des rares exemples de récepteur couplé à une guanylate cyclase: Quand le peptide se fixe sur son récepteur cela active l’activité enzymatique qui induit la production de GMP cyclique à partir de GTP.

Quelles sont les étapes de la signalisation ? Molécule de signalisation extracellulaire Récepteur membranaire Protéines de signalisation intracellulaires Protéines du cytoplasme Protéines cibles Facteur de transcription Modification du métabolisme, de la structure cellulaire Modification de l’expression des gènes

Réponse de la cellule et cycle cellulaire Mitogènes Signaux de mort Agent de différenciation G2 M G1 S G2 M G1 S G2 M G1 S Différenciation Apoptose Prolifération

Les récepteurs à activité tyrosine kinase

Famille des Récepteurs à activité Tyrosine Kinase (RTK) D ’après P Blume-Jensen and T Hunter, Nature 2001: 411, 355

Les ligands des RTK Epidermal Growth factor (EGF) Récepteur à l’EGF (EGFR) Stimule la prolifération de nombreux types cellulaires Insulin Growth factor (IGF 1 et 2) Récepteur à l’IGF1 (IGF1 R) Stimule la croissance cellulaire et la survie Nerve Growth factor (NGF) Récepteur au NGF (NGFR) Stimule la croissance cellulaire et la survie de nombreux neurones Platelet-derived Growth factor (PDGF) Récepteur au PDGF (PDGFR) Stimule la croissance, la survie et la prolifération de nombreux types cellulaires Macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) Récepteur au M-CSF (M-CSFR) Stimule la prolifération des monocytes/macrophages et la différenciation Fibroblast Growth factor (FGF) Récepteur au FGF (FGFR) Stimule la prolifération de nombreux types cellulaires et inhibe la différenciation de certains précurseurs cellulaires

Dimérisation du récepteur La dimérisation du récepteur RTK PDGF Dimérisation du récepteur La fixation du ligand induit une dimérisation (ou oligomérisation du récepteur)

Dimérisation du récepteur Activation de l’activité kinase L’activation du récepteur RTK PDGF PDGF PDGF P P P Dimérisation du récepteur Activation de l’activité kinase Autophosphorylation du récepteur La dimérisation du récepteur induit l’activation de l’activité tyrosine kinase du récepteur et ainsi son autophosphorylation

Signalisation intracellulaire et phosphorylation Activateur non phosphorylé (non actif) KINASE PHOSPATASE (ajout d’un groupement phosphate) (élimination d’un groupement phosphate) Activateur phosphorylé (actif) La transduction intracellulaire du signal se fait par un mécanisme de phosphorylations intracellulaires

Signalisation intracellulaire et phosphorylation Récepteur phosphorylé et actif Activation de protéines kinases intracellulaires Cascades de phosphorylations intracellulaires

Domaines de reconnaissance des résidus tyrosines phosphorylées Phosphorylation de tyrosines du domaine porteur de l’activité kinase Contrôle de l’activité kinase du récepteur Phosphorylation de tyrosines dans des zones non catalytiques P P P Sites de liaison des domaines SH2 (Sarc homology 2) ou PTB (phosphotyrosine binding) présents au sein de nombreuses protéines

Interaction tyrosine phosphorylée / domaine SH2 Jaune : récepteur avec la tyrosine phosphorylée (groupement phosphate en rouge) Blanc: domaine SH2 Le phosphate est chargé négativement. Il vient s’insérer dans la poche positive du domaine SH2

Activation des voies de signalisation Induction de la cascade d’activation intracellulaire P P P P P P Recrutement de médiateur à la membrane via une interaction domaine SH2/tyrosine phosphorylée

Les grandes voies de signalisation induites PDGF Voie des MAP kinases (mitogen-activated protein kinase) P Voie de la PI3 kinase/Akt P P Activation des facteurs de transcription et expression des gènes Prolifération

La voie de la PI3-kinase/Akt La protéine PI3-kinase (phosphatidylinositol 3-kinase) est constitué de deux sous-unités : une sous-unité régulatrice, p85: elle contient deux domaines SH2 une sous-unité catalytique p110 PDGF La PI3kinase est recrutée au niveau du récepteur via les domaines SH2 qui constituent sa sous unité régulatrice P PI3K P p110 P p85

L’activation de la PI3-kinase L’association de la PI3-kinase aux tyrosines phosphorylées du récepteur induit une modification conformationnelle de la protéine Activation de la sous-unité catalytique de la PI3-kinase

La PI3-kinase phosphoryle les lipides membranaires Les lipides membranaires ainsi phosphorylés jouent le rôle de 2nd messagers

L’activation de la protéine Akt (protein kinase B ou PKB) Les lipides membranaires phosphorylées servent de point d’ancrage à deux protéines kinase: les phosphoinositide-dependent kinase, la PDK1 et Akt

L’activation de la protéine Akt (PKB) L’interaction se fait via des domaines particuliers appelés domaines PH (domaine Pleckstrin homologie) L’interaction de Akt avec les lipides permet un changement de conformation. Akt peut alors être phosphorylé et donc activé par PDK1

Akt induit la prolifération Akt va induire la prolifération cellulaire de différentes façons: il induit l’activation du cycle cellulaire il active des facteurs de transcription qui vont permettent l’expression de gènes impliqués dans la prolifération il bloque l’apoptose

Akt bloque la dégradation de la cycline D P GSK3b GSK3b Actif Inactif P Cycline D Cycline D Ubiquitination et dégradation de la protéine Akt inhibe la phosphorylation de la cycline D en inhibant la kinase GSK3b (Glycogen synthase kinase). Il bloque ainsi la dégradation de la cycline D

Akt active le facteur de transcription NF-kB I-kB est un inhibiteur du facteur de transcription NF-kB I-kB NF-kB Le facteur de transcription reste dans le cytoplasme Akt Phosphorylation de I-kB Dégradation de I-kB Libération de NF-kB NF-kB migre dans le noyau et induit l’activation des gènes

Rétrocontrôle de la voie PI3-Kinase/Akt PI(4,5)P2 PI(3,4,5)P3 PTEN PTEN (Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10) déphosphoryle les lipides membranaires PTEN: Phosphatase and tensin homologue déléted on chromosome ten Décrochage de Akt de la membrane plasmique Inactivation de Akt et arrêt du signal

La voie PI3-kinase/Akt et cancers Dans des conditions normales :

La voie PI3-kinase/Akt et cancers Dans les gliomes (tumeurs cérébrales), PTEN est inactivé PTEN est un gène suppresseur de tumeur

Résumé Voie de la PI3 kinase/Akt Voie des MAP kinases PDGF Voie de la PI3 kinase/Akt Voie des MAP kinases P P P Augmente la quantité de cycline D Active le facteur NF-kB Prolifération

La voie des MAPK (Mitogen Activated protein kinase) Chez les Mammifères, la voie des MAPK se divisent en 4 sous-familles: la voie Erk1/2 (extracellular signal-regulated kinase) la voie Jnk (Jun kinase) la voie p38 la voie Erk5 L’activation de ces différentes voies dépend du type cellulaire et du signal extracellulaire impliqué

La cascade d’activation des MAPK Les MAPK sont activées par une cascade de protéines kinases Stimulus Facteur de croissance Activateur Ras Rac MKKK Raf MEKK1 MKK MKK1 MKK4 MAPK Erk1/2 Jnk Substrat Elk1 c-jun

La voie Erk1/2 Interaction avec les Ptyr du récepteur Domaine SH2 PDGF Domaine SH2 PI3K P P Domaine SH3 p110 p85 P P Grb2 sos Grb2: Growth factor receptor bound protein 2 Sos: son of sevenless Interaction avec la région riche en proline de Sos Grb2 est un adaptateur qui permet le recrutement la protéine Sos à la membrane au niveau du récepteur

Activation de Ras par Sos PDGF ras ras P P GDP GTP Inactif P Actif P Grb2 sos Sos est un facteur d’échange de nucléotides guanine (GEF) qui permet l’activation de ras

Activation de Raf par Ras L’association de ras avec Raf modifie l’interaction entre Raf et les protéines 14-3-3 du cytoplasme Inactif Raf adopte une conformation active Raf: ras associated factor actif

La Famille des Protéines GTPases Ras Ras Rho Rab Arf Ran H-Ras N-Ras K-Ras TC21 Rap1 Rap2 R-Ras RalA RalB RhoA RhoB RhoC RhoG RhoE CDC42 Rac1 Rac2 Rab1-N Arf1-6 Ran Transport Nucléaire . Ras est le Membre Fondateur d’une Famille de plus de 70 GTPases . Très conservée: les 164 acides aminés du ras humain et poulet ne diffèrent qu’à deux positions . La Conservation Témoigne de Fonctions Essentielles à la Cellule. Cytosquelette Migration Prolifération Différenciation

Activation de Erk1/2 Raf => MKK1 (Map kinase kinase) Mise en place d’un cascade de phosphorylation par des protéines sérine/thréonine kinases Raf actif P MKK1 MKK1 inactif actif P Erk1/2 Erk1/2 inactif actif Migration dans le noyau de la cellule

Erk1/2 induit l’expression de c-fos noyau P Erk1/2 P Elk1 Elk1 Facteur de transcription inactif actif P Elk1 ++ Expression de c-fos Gène c-fos

La voie des Jnk Rac comme Ras est une petite GTPase Inactif Actif Facteur de croissance Rac comme Ras est une petite GTPase Ras Rac Raf MEKK1 GDP Rac Inactif MKK1 MKK4 GTP Actif Erk1/2 Jnk Rac Elk1 c-jun

c-Jun N-terminal kinases La voie des Jnk c-Jun N-terminal kinases MEKK1 Inactif Rac MEKK1 actif P MKK4 MKK4 inactif actif P Jnk Jnk inactif actif Migration dans le noyau de la cellule

Comment se fait l’activation de Rac ? GTP GDP Rac Rac Vav, Sos Inactif actif Vav et Sos sont des GEF (Guanine nucleoside exchange factor) capable d’activer Rac

Comment se fait l’activation de ces GEF ? Il existe différentes voies d’activation Vav possède un domaine PH (domaine Pleckstrin homologie). Il peut ainsi être activé par la PI3-K PIP3 Domaine PH Vav Activation de Vav La voie des MAPK et la voie de la PI3-K sont interdépendantes

Comment se fait l’activation de ces GEF ? La phosphorylation de Sos contrôle les interactions avec ces partenaires protéiques P sos Grb2 Grb2 sos P sos E3b1 Eps8 Sos a une activité Ras-GEF activé Sos a une activité Rac-GEF activé Activation de Ras et de la voie Erk1/2 Activation de Rac et de la voie Jnk

La voie de Jnk : récapitulatif Activation de la PI3-K Vav s’associe aux lipides phosphorylés Activation de Vav Activation de la voie Jnk Activation de Rac P Activation de l’activité Rac-GEF de Sos P P Sos s’associe à E3b1 et Eps8 Erk1/2 phosphoryle Sos et bloque son association avec Grb2 Activation de la voie Erk1/2

Jnk phosphoryle le facteur de transcription c-jun Une fois activé, Jnk migre dans le noyau ou il induit la phosphorylation de c-jun sur deux résidus sérines

Le facteur de transcription AP1: Les MAPKs stimulent le facteur de transcription AP1 (adaptor-related protein complex 1) Le facteur de transcription AP1: c-fos c-jun P P Erk1/2 Jnk cytoplasme noyau P P Erk1/2 Jnk Induction de l’expression Phosphorylation de c-jun P Activation du facteur de transcription AP1 c-fos c-fos c-jun

AP1 active l ’expression du gène de la cycline D - Gène cycline D P c-fos c-jun Gène cycline D Cycline D Cycline D Cycline D Cycline D Cycline D Activation du cycle cellulaire

Résumé Voie des MAPKs Active Erk1/2 Active Jnk PDGF Voie des MAPKs Active Erk1/2 Active Jnk Voie de la PI3 kinase/Akt Phosphoryle c-jun Induit c-fos P P P Augmente la quantité de cycline D Active le facteur AP1 Active le facteur NF-kB Induit l’expression de la cycline D Prolifération

Voie des MAPKs et Cancer Dans de nombreux cancers, Ras présentent une mutation ponctuelle, qui le rend constitutivement actif Ras muté et autoactif MAPK toujours actives Prolifération Ras est un ONCOGENE

Les récepteurs aux cytokines Les récepteurs aux cytokines n’ont pas d’activité kinase intrinsèque, ils sont associées à des protéines kinases cytoplasmiques Les cytokines sont des petites protéines qui contrôle la réponse immunitaire. Elles peuvent induire différentes réponses biologiques: inflammation, prolifération ou encore différenciation Les études sur les voies de signalisation suite à une stimulation par les récepteurs aux cytokines ont permis de caractériser la voie Jak/STAT

L ’exemple de l’IL-6 Jak Jak Jak Jak Jak IL-6 IL-6 P P Les protéines kinases Jak (Janus kinase) sont constitutivement associées aux récepteurs Dimérisation du récepteur et acivation des protéines Jak Dimérisation du récepteur et acivation des protéines Jak

signal transducer and activator of transcription (STAT) L ’activation des facteurs STAT3 signal transducer and activator of transcription (STAT) IL-6 IL-6 Jak Jak Jak Jak P P P P Stat3 Stat3 P Domaine SH2 Les protéines kinases Jak phosphorylent les facteurs Stat3 sur un résidu tyrosine Les facteurs de transcription Stat3 sont recrutés au niveau du promoteur via leur domaine SH2

L ’activation des facteurs STAT3 IL-6 Stat3 Dimérisation des protéines Stat3 P P Stat3 noyau Jak Jak Translocation nucléaire P P Stat3 P Stat3 P P Stat3

Les facteurs STAT3 activent l’expression des gènes - Gène cible Stat3 P P ++ Stat3 Parmi les gènes cibles de Stat3 se trouvent de nombreux gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire

La voie Jak/Stat et Cancer Le facteur de transcription Stat3 est constituvement actif dans de nombreux cancers Les cellules forment des colonies en milieu agar cDNA Stat3 cis Les cellules induisent la formation de tumeurs dans des souris nude Transfection Fibroblaste de souris Les facteurs de transcription STAT3 sont impliqués dans le processus d’oncogenèse

Les récepteurs à activité enzymatique intrinsèque Différentes activités enzymatiques intrinsèques ont été mise en évidence : Activité tyrosine kinase (PTK) Ex : le récepteur au PDGF, à l’EGF ou les récepteurs aux cytokines Activité sérine/thréonine kinase Ex : le récepteur au TGF Activité tyrosine phosphatase (PTPase) Ex : CD45 Activité guanylate cyclase Ex : Récepteur à l’ANF (Atrial Natriuretic factor)

Le récepteur au TGFb TGFb : Transforming growth factor b Le récepteur au TGFb est constitué de deux sous unités différentes TbR-I TbR-II Domaine intracellulaire à activité kinase + + Autophosphorylation - + Phosphorylation de l’autre sous-unité - + TbR-II TbR-I Phosphorylation des Smad + -

L’activation du récepteur au TGFb TbR-II TbR-I Le TGFb induit un rapprochement des chaines réceptrices Phosphorylation et activation de l’activité kinase de TbR-I Activation de l’activité kinase de TbR-II

L’activation des facteurs de transcription Smad Translocation nucléaire P Smad4 Hétéro dimérisation P Smad2/3 P Smad2/3 Activation de la transcription Smad4 P Smad2/3 ++ Smad4