Lésions d’ischémie reperfusion : le cauchemar du transplanteur

liées à la réoxygénation liées au réchauffement/ Principaux mécanismes lésionnels au cours de l’ischémie reperfusion Ischémie froide Reperfusion Lésions d’hypoxie Lésions chroniques Réaction inflammatoire Lésions liées à la réoxygénation Lésions d’hypothermie Lésions liées au réchauffement/ Apoptose induite par la conservation T Hauet

En cas de DDAC : des lésions en 3 temps… Ischémie Hypothermie Revascularisation

Lésions d’ischémie reperfusion : Conséquences cliniques Effet à long terme Ni RRF ni RA RA RRF RRF + RA Effet respectif de la reprise retardée de fonction et du rejet aigu (Tx rénale)

Rôle central de la mitochondrie Chaque jour un adulte utilise (et recycle) une quantité d'ATP équivalente à 75 % de son poids corporel ! Dans les conditions de repos, un tiers est utilisé pour le fonctionnement des pompes membranaires comme les ATPases

La phosphorylation oxydative matrice membrane interne externe espace intermembranaire Mitochondrie réactions d ’oxydo- réduction: transfert d ’e- I III IV CoQ CoQH2 NaDH,H+ FADH2 NaD+ FAD H+ 1/2 O2 H2O F1 F0 ADP + Pi ATP II

Ischémie = arrêt de la phosphorylation oxydative glucose ATP NADH, H+ glycolyse - O2 pyruvate +O2 NADH, H+ FADH2 acétyl CoA lactate cycle de Krebs Acidose

Le bilan énergétique n’est pas brillant… 1 mole de glucose Métabolisme aérobie Métabolisme anaérobie 38 moles d’ATP 2 moles d’ATP 2 mol. d’a lactique

Monoréduction physiologique 3 à 5% Il existe une production radicalaire physiologique au niveau mitochondrial Monoréduction physiologique 3 à 5% H2O2 OH° O2 °- e- O2 h 1O2 4 e- Tetraréduction Bien qu'acceptant toujours au total quatre électrons pour former H2O, l'oxygène sera réduit par étapes monovalentes, produisant ainsi trois types d'intermédiaires réactifs, le radical superoxyde, O2.-, le peroxyde d’hydrogène H2O2 et le radical hydroxyle OH.-. Ces espèces vont alors soit indirectement favoriser, soit directement initier des réactions en chaîne dont la première étape est souvent la rupture homolytique des liaisons carbone-hydrogène ou l’addition sur les doubles liaisons carbone-carbone des biomolécules constituant le"squelette" de la cellule (phospholipides, protéines, acides nucléiques). Il existe des systèmes antioxydants naturels de régulation et de protection de nature enzymatique (superoxyde dismutases (SOD), catalases et peroxydases) et non enzymatique (vitamines C et E, glutathion réduit). Mais ceux-ci peuvent s’avérer insuffisants lorsque le flux d’espèces oxydantes est trop important, ce qui peut être le cas en situation pathologique. H2O 95% O2 °- = anion superoxyde OH ° = radical hydroxyle H2O2 = peroxyde d ’hydrogène 1O2 = oxygène singulet

Qu’est-ce qu’un radical libre ? Un radical libre (RL) est constitué par tout atome, groupe d’atomes ou molécules où au moins un électron non apparié occupe une orbitale externe [•] Le radical s’en trouve doté d’une réactivité particulière et peut ainsi réagir avec d’autres atomes ou molécules et se comporter, selon le cas, comme un oxydant ou comme un réducteur, afin d’apparier son électron célibataire Radical libre… de nuire ! Bref, c’est la patate chaude… B Barrou, T Hauet EFPMO Juin 2009

Conséquences de l’ischémie : la lecture biochimique Privation d’O² et nutriments Accumulation de déchets ischémie Inhibition du métabolisme oxydatif Déplétion en ATP Glycolyse anaérobie hypoxanthine Inhibition pompes Na/K Acide Lactique Instabilité lysosomale Pertes électrolytes Œdème intraCel. Libération Enzymes lytiques Ph ↓ Activité protéases et phospholipases Ouv canaux Ca++  Ca++ cytosol Production radicaux libres Altération cytosquelette, protéines Peroxydation lipides membranaires

Le paradoxe de la reperfusion Ischémie Reperfusion

Syndrome de reperfusion X 100 Perico N, Lancet 2004, 364: 1814-1827

Conséquences immunologiques de l’IRI

Conséquences de l’ischémie : la lecture immunologique lésions tissulaires Ligands endogènes des TLR La costimulation indispensable provient de l’ischémie via la voie des TLR Immunité innée Engagement TLR sur DC Maturation DC CD80 CD86 sur DC Migration DC vers OL II Alloantigène Activation des LT naifs Ag spécifique  Alloreconnaissance Evènements Ag indépendants, non spécifiques Evènements Ag dépendants, spécifiques

Théorie du signal danger version chirurgicale Alloreconnaissance + inflammation Alloreconnaissance

Ligands endogènes des TLR : les «DAMPs» damage associated molecular pattern molecules TLRs, including TLR2 and TLR4, could function as: detectors of sterile (not pathogen-associated) injury upon binding to endogenous ligands released by damaged cells damage-associated molecular patterns, (DAMPs). Examples of putative endogenous ligands heat-shock proteins, high-mobility group box 1 (HMGB1), heparan sulfate, hyaluronan fragments, fibronectin . Is it true in the clinical setting ?

TLR4 Expression Human kidney biopsy before reperfusion Cold isch: 0.5 h (n=15) Cold isch: 20 h (n=9) TLR4 expression in implantation biopsies. (A) Preanastomosis biopsy sections (×200) from living- (n = 15) and deceased-donor kidneys (n = 9) were analyzed by immunohistochemistry for TLR4. TLR4 was expressed in proximal and distal tubuli, with higher expression in deceased-donor kidneys compared with living donors (P = 0.016). The amount of TLR4 protein quantified correlated with their respective mRNA expression levels (P = 0.0014). (B) TLR4 mRNA expression levels in preanastomosis biopsies was significantly higher in samples from deceased donors (n = 28) compared to samples from living donors (n = 18). Box and whisker blots show the medians, and the percentile values (10, 25, 75, 90) for normalized mRNA. TLR4 is expressed in normal human kidneys TLR4 is significantly upregulated by ischemic injury Krüger et al. Blood 2009 18

HMGB1 expression in implantation biopsies HMGB1 expression in implantation biopsies. HMGB1 was localized in distal and proximal tubules from deceased-donor kidneys (DD) obtained prior anastomosis. However, no HMGB1 staining was observed in living-donor kidneys (LD). Glomeruli (*indicates border) were negative for HMGB1 for both types of donors (n = 5 each group; ×200). Krüger et al. Blood 2009 LD = living donor, DD = deceased donor 19

HMGB1-induced TLR4-mediated inflammation Krüger et al. Blood 2009 HMGB1-induced TLR4-mediated inflammation. (A) qRT-PCR analysis of cytokine genes of proximal tubular cell line (HK-2). Cells were cultured without (Unstim) or with the TLR4-specific ligand LPS (1 μg/ml) or with rHMGB1 (5 μg/ml) (n = 3–7 per group; *P < 0.05 compared with unstimulated controls). (B) Western blot shows TLR4 expression of HK-2 cells transfected with control siRNA (lane 1: 62.5 nM; lane 2: 125 nM), or TLR4 siRNA (lane 3: 62.5 nM; lane 4: 125 nM). GAPDH and tubulin (not shown) staining was used as a loading control. HK-2 cells were transfected transiently with control siRNA or siRNA (125 nM each) against TLR4 and then stimulated with rHMGB1 as described in (A) (n = 3 each; *P < 0.05). (C) HK-2 cells were cultured for 30 min with monoclonal anti-TLR4 antibody or isotype (IgG) control (20 μg/ml each) and then stimulated with rHMGB1 (5 μg/ml) as described in (A) (n = 4 each; *P < 0.05). rHMGB1 stim Proximal tubular cell line (HK-2) cultured without (Unstim) or with the TLR4-specific ligand LPS (1 μg/ml) or with rHMGB1 (5 μg/ml) 20

TLR2 Expression: kidney >> Leukocytes Kidney TLR-2-/- Leukocytes TLR-2-/- Leemans /Florquin et al. J Clin Invest. 2005

TLR4 Expression: kidney >> Leukocytes Functional TLR4 on intrinsic kidney cells makes the more significant contribution to kidney damage. WT/WTBM mice showed significant kidney dysfunction and injury at day 1 after ischemia/reperfusion, while TLR4–/–/TLR4–/–BM chimeric mice were protected from kidney IRI as measured by day 1 serum creatinine (A) and tubular damage (B). Creatinine levels and tubular injury scores replicated those observed in WT and TLR4–/– mice (Figures 5 and 6), excluding an effect of the BM transplant procedure per se on the response to renal ischemia. Moreover, TLR4–/–/WTBM chimeras were protected from kidney IRI to the same degree as TLR4–/–/TLR4–/–BM mice, while WT/TLR4–/–BM mice enjoyed only partial protection as assessed by day 1 serum creatinine and tubular damage (A and B). Data shown are mean ± SD. n = 7–10 per group. *P < 0.05, **P < 0.01, *** P < 0.001. Full replacement of hematopoietic cells in the chimeric mice was confirmed by genotyping of genomic DNA from whole blood using PCR. PCR products shown on representative gels (C). The top panel represents PCR products for the WT allele DNA, and the bottom panel represents PCR products for the mutated allele DNA (lanes 1–2: WT/WTBM; lanes 3–4: WT/TLR4–/–BM; lanes 5–6: TLR4–/–/WTBM; lanes 7–8: TLR4–/–/ TLR4–/–BM; lane 9: TLR4 heterozygous blood as positive controls; and lane 10: negative controls). Kidney: WT, leuco: KO Kidney: KO, leuco: WT Huiling Wu et al. J Clin Invest. 2007 22

Differences between organs TLR4 dependent liver ischaemia reperfusion injury sALT (international units/liter) levels after hepatic warm ischemia/reperfusion. The sALT levels, an indicator of hepatocellular injury, were measured in parallel in blood samples from WT, and TLR4, TLR2, MyD88, and IRF3 KO mice that were subjected to 90 min of ischemia followed by 6 h of reperfusion. Mean ± SD are shown (n = 4–5/group). *, p < 0.001. Each experiment was performed at least twice at different occasions. Zhai et al. J. Immunol. 2004 23

Principes de conservation Conserver en hypothermie : Loi de Van’t Hoff :  activité enzymatique de 50% par pallier de 10°C 10 à 12 % du métabolisme persiste à 4°C Limiter l’œdème intracellulaire : Imperméants : qui « imperméabilisent » la membrane Colloïdes :  pression oncotique dans compartiment vasculaire Limiter la perte énergétique (stock en ATP) : Composition extracellulaire des solutions Prévenir l’acidose intracellulaire… mais pas trop : Sévère : activation phospholipases, protéases Modérée (6.9 – 7) : inhibition fructokinase  glycolyse Prévenir les lésions oxydatives des radicaux libres : Chélation ? La plupart sont produits lors de la reperfusion… Développer la préservation dynamique Immunomasquage : Théorie du signal danger (Polly Matzinger)

Solution intra ou extra cellulaire ? Na+ Na+ K+ K+ Niveau ATP En ischémie :  lésions des membranes  02  ATP   de l’activité des pompes

Effect of depolarizing (high K+) solutions 31P Magnetic Resonance Spectroscopy of Isolated perfused rat kidney (37°C + continuous perfusion 95%O2 5% CO2) ATP (%) Effect of depolarizing (high K+) solutions low K+ 120 100 80 Krebs - PEG 30 g/L 60 high K+ 40 Eurocollins 20 U W C 1 2 3 4 5 6 7 8 time (h) Bauza G, Hauet T, Eugene M Laboratoire de RMN - Physiologie - Cryobiologie- Michel EUGENE

Comment limiter ces lésions ? Les solutions de préservation Composition extracellulaire : K+ bas Lutter contre le spasme Effects of elevation in external K+ concentration on contractile force and membrane potential in rabbit MCA Gokina et al Am.J Physiol Heart Circ.Physiol 278:H2105-H2114, 2000 M Eugène

activité Na-K ATPase  entrée passive Na+  œdème cellulaire Imperméants Colloides Agissent au niveau interstitium et mbe Anions non saccharidiques saccharides Glucose (monoS de PM 180) : abandonné car produisant des lactates  Eurocollins Mannitol (monoS de PM 182) : propriétés anti-oxydantes  Marshall’s, HTK, celsior Sucrose (diS de PM 342)  PBS Raffinose (triS de PM 504)  UW Gluconate Citrate Lactobionate tous chargés négativement Agissent par propriétés électro-chimiques

 activité Na-K ATPase  entrée passive Na+  œdème cellulaire Imperméants Colloides Agissent au niveau du compartiment vasculaire HES (amidon)  UW PM > 106 daltons  viscosité,  agrégation GR Dextran : PEG : SCOT 15, IGL1 différentes longueurs de chaine immunomasquage

L’avenir : la préservation normothermique ? Eviter l’hypothermie, qui a des effets délétères en elle-même Dissocier les paradoxes de la réadministration d’O2 de l’effet cataclysmique des leucocytes lors de la reperfusion Par une solution acellulaire capable de transporter l’O2 Restauration de la phosphorylation oxydative Induction de mécanismes de réparations des lésions d’ischémie Avant la seconde claque de la reperfusion En dehors de toute inflammation et de toute infiltration du greffon par les leucocytes Induction de facteurs susceptibles d’induire des phénomènes de réparation cellulaire et de prévenir les lésions de reperfusion : Hème Oxygénase I HSP 70 …

Place respective des différentes modalités… Viaspan, statique, 4° Mox 100, viaspan, 4° Perfusion pulsatile 32°, EMS + Hb bov + 02 Modèle d’autotransplantation chez le chien, sans ischémie chaude initiale Brasile L, AJT 2003, 3: 674-9

Conclusion Une bonne greffe commence par une bonne préservation L’ischémie froide doit rester la plus courte possible Les chirurgiens doivent connaître les lésions d’IR et les différentes solutions de préservation La préservation sur machine pour les reins va concerner 1/3 à la 1/2 des greffons Nombreuses perspectives de réanimation ex vivo des greffons Laboratoires de perfusion ?