Quel modèle animal ?

Quelle mesure fonctionnelle ?

L’épithélium respiratoire trachéo-bronchique: histologie (rappels) rôles physiopathologie de l’asthme

EPITHELIUM RESPIRATOIRE continu (complexes jonctionnels) de type cilié de hauteur variable pseudostratifié Tr / Br unistratifié br distales

EPITHELIUM RESPIRATOIRE 8 types cellulaires situation basale • C. basales • C. Kultschitsky situation superficielle • C. ciliées C. non ciliées sécrétrices • C. à mucus • C. Clara non sécrétrices • C. intermédiaires • C. en brosse • C. mixtes: ciliées et à mucus

CELLULES CILIÉES CELLULES à MUCUS prédominantes (1 c. à mucus / 5 c. ciliées) prismatiques avec cils vibratils noyau basal mitochondries apicales ++ associées aux corpuscules basaux CELLULES à MUCUS prismatiques, évasées (cellules caliciformes) grains de sécrétion grands, floculeux, riches en glycoprotéines de haut PM (mucines) responsables de la viscoélasticité du mucus sécrétion accrue et accélérée en cas d'agression prolifèrent en cas d'agression chronique progénitrices des C. ciliées

CELLULES en BROSSE cellules immatures impliquées dans la dépourvues de cils microvillosités apicales corpuscules basaux, parfois cellules immatures impliquées dans la régénération de l'épithélium

CELLULES SÉREUSES CELLULES BASALES épithélium respiratoire fœtus, rat épithélium des glandes trachéobronchiques + CELLULES BASALES cellules ovoïdes reposant largement sur la membrane basale assurent l'ancrage de l'épithélium respiratoire par des: - hémidesmosomes (face basale) - desmosomes (faces latérales) nombre corrélé à la hauteur de l'épithélium

CELLULES INTERMÉDIAIRES cellules indifférenciées progénitrices des autres cellules épithéliales responsables de l'aspect pseudostratifié de l'épithélium respiratoire (intercalées entre les autres types cellulaires sans atteindre la basale ni la lumière)

EPITHELIUM BRONCHIOLAIRE cellules basales peu nombreuses, absentes dans les zones distales cellules ciliées cellules à mucus progressivement remplacées par: cellules de Clara

L’éotaxine est produite par les cellules épithéliales mais pas seulement!

Epithélium respiratoire et immunité Cellules présentatrices de l’Ag: monocytes/macrophages, cellules dendritiques/Langerhans Lymphocytes T, B Polynucléaires neutrophiles, éosinophiles, basophiles/mastocytes

EPITHELIUM RESPIRATOIRE et IMMUNITÉ - à l'état normal: • existence de lymphocytes intraépithéliaux ou regroupés en structures organisées associées aux bronches (BALT: chez le rongeur) • présence de c. de Langerhans intraépithéliales • expression épithéliale des molécules de classe II en pathologie: infiltration accrue par Ly au cours des réponses immunitaires et inflammatoires, développement des BALT lors d'infections bronchiques, expression augmentée des classe II dans asthme et rhinite allergique

Physiopathologie de l’asthme

Les lymphocytes « TH1, TH2 »

Asthme et réponse TH2

L’éosinophile dans l’asthme

Eosinophil-derived proteins Toxic granule protein Function Major basic protein Cytotoxic to respiratory epithelium Degranulation of mast cells Increased smooth muscle activity Eosinophil cationic protein Eosinophil-derived neurotoxin Ribonuclease activity Cysteinyl leukotrienes Increase vascular permeability Smooth muscle contraction Increase mucus secretion RANTES Eosinophil chemoattractant Eotaxin 1 and 2 Th-2–type cytokines Perpetuation of Th-2 inflammation

Le mastocyte dans l’asthme Entretien de l’inflammation

La bronche de l’asthmatique

Agression et inflammation Liens mésenchyme - épithélium Activation épithéliale Activation des fibroblastes

Deux types de réponse à l’agression chronique: l’inflammation chronique ou le remodelage Myofibroblastes transitoires Inflammation aiguë répétée cicatrisation Remodelage (Épaississement MB, hypertrophie cml…) Inflammation chronique à éosinophiles switch ? maladie Symptômes Altérations fonctionnelles Corticoïdes sensible Insensible aux corticoïdes ?

Asthme : épidémiologie Prévalence de 5.8 % en février 2000 En France (1998) : 3.5 M d’asthmatiques Mortalité: 4/100 000 hab./an en France (1990) 2000 morts/an en France (2001)

Physiopathologie de l’obstruction bronchique dans l’asthme HYPERREACTIVITE OBSTRUCTION INFLAMMATION Stimulation du SN végétatif

Asthme et modèles animaux - Evaluation de la mécanique respiratoire des rongeurs - Choix des modèles animaux - Modèles animaux d’hyperréactivité bronchique

Evaluation de la mécanique respiratoire chez la souris (1) 1) Techniques nécessitant la « bipneumonectomie » Mesure de la contraction de segments isolés des voies aériennes : étude de la réponse contractile isométrique ou isotonique (soluté physiologique -transducteur de force ou mouvt): mediateurs contractiles ou stim électrique des CML - : secretions in vivo (étude de le contraction musc seule) innervation et circulation bronchique non étudiées + : trachée isolée sensibilisée Ag plus réactive que trachée contrôle donc la contractilité de la CML intervient dans l’HRB

Evaluation de la mécanique respiratoire chez la souris (2) Mesure du volume de gaz piégé : souris: seul le poumon (Pel) influence la CRF (pas la paroi thoracique) tonus des VA, certaines VA peuvent être fermées à la CRF si BC   vol air piégé (trapping) mesuré par principe d ’Archimède + : facile, état in vivo à l’euthanasie, rés. id metach A/J vs C3H/HeJ - : 1 mesure/souris, relation obstruction VA gaz trappé ? (petites VA) Mécanique sur poumon isolé volume, débit, pr transpulm  compliance statique et dyn, résistance non utilisé pour les tests de BC (fermeture hétérogène des VA)

Evaluation de la mécanique respiratoire chez la souris (3) 2) Techniques nécessitant l’anesthésie et l’intubation +: exclut les VAS (résistance); contrôle de la FR et du mode ventilatoire respect innervation, mesures répétées (<6h), effets cellulaires et bioch -: effets des anesthésiques (neuro, vascul, agoniste/antagoniste récepteurs) Pression des VA lors de la ventilation VT et FR fixes, profil P/t modif par stim BC (Airway Pressure Time Index) +: simple -: mesure globale de l ’impédance respiratoire(RVA? Compliance pulm?) pression d’occlusion Rr = Pr /débit Cr = V/P(fin occlusion - CRF) +: modif isolée Rr = grosses VA et modif isolée Cr = petites VA -: mesure Rr inspiratoire, interruption de la ventilation

Enregistrement de la pression trachéale chez l’animal anesthésié (VT et FR fixes) Pb: variations de RVA et/ou élasticité pulmonaire

Evaluation de la mécanique respiratoire chez la souris (4) Mesure de la résistance et de la compliance dynamique VT , débit, pression transpulmonaire PTP = débit x Rpulm + VT / Cdyn PTP = P trachéale - P pleurale (thoracotomie bilatérale, EEP>Patm) V pléthysmographie; PTP et VT en phase +: enregistrement continu Rpulm et Cdyn -: techniquement difficile Mesure de la résistance et de la compliance avec capsules alvéolaires 3) Techniques non invasives +: même animal , mesures répétées -: chgt de l’ouverture de la glotte, résistance nasale  modif R resp oscillations forcées (Po/débit=R) P oscill surface corporelle  mesure de débit généré à l’ouverture des VA -:FR élevée, masque nasal modifie le contrôle neurol ventilatoire Plethysmographie inspir  réchaufft de l’air  modif P mesurées lors du cycle ventilatoire

Plethysmographie

Calcul de la pause et de la pause augmentée (Penh) Pause = (Te – Tr) / Tr Penh = PEP/PIP x (Te – Tr) / Tr NB: Pas d’interférence avec les R des VAS des rongeurs

Augmentation de la Penh après provocation à la metacholine

Modèles animaux et asthme (1) Pas d’asthme allergique dans le monde animal Depuis 1990 nombreuses publications décrivant des modèles de maladies allergiques (pour le développement de nouvelles molécules pharmaceutiques) … chaque modèle ± avantage mais  de la maladie humaine Mécanisme exploré 1) Réponse précoce : bronchospasme aigü - Pas de modèle murin, rare chez le rat (Donryu>Wistar) - Cobaye +++ : OVA /conscient ou anesthésié/ fr,Vt, Rl, Cdyn /ip, iv, sc, im, po -  Bronchospasme levé par 2 agonistes, antimuscariniques, anti-H1 chez cobaye  homme / ± antagoniste des LT, inhib des PDE

Modèles animaux et asthme (2) 2) Réponse tardive - souris ? / Rat Brown Norway (OVA) - cobaye (OVA ip puis inhalé  B/C 17 à 24h + eosino) - lapin, mouton, chien, cochon ± metapyrone, singe (ascaris) PAS DE MODELE D’INFLAMMATION CHRONIQUE DES VOIES AERIENNES 3 ) Hyperréactivité bronchique Aptitude des VA à répondre à des stimuli bronchoconstricteurs

Différents modèles animaux utilisés

Modèles animaux d’hyperréactivité bronchique (1) Grande variabilité entre animaux d ’espèces différentes et entre animaux de même espèce Réactivité bronchique aux stimuli directs Agonistes cholinergiques (acétylcholine, métacholine et carbachol), histamine, PGF2, LT, serotonine comparaisons entre espèces difficiles pour la métacholine : réponse maximale et sensibilité élevées pour cobaye > rat > lapin >chat > chien (sauf Basenji-greyhound=HRBNS naturelle) déterminants in vivo : force de contraction vs impédance du raccourcissement (Pel parenchyme, cartilage, rigidité par repliement de la muqueuse…) quantité de muscle lisse (cobaye > rat ou lapin) maturation (variation métabolisme des phosphoinositides) génétiques (Basenji-greyhound, rat , souris, cobaye)

Modèles animaux d’hyperréactivité bronchique (2) Réactivité bronchique aux stimuli indirects (cellules effectrices autres que musculaire lisse) Adénosine , neurokinine A (mastocytes) Bradykinine (B1,B2 - eos/macrophages et fibres NANC) cf rats sensibilisés antagonistes des récepteurs B2 Hyperréactivité induite par mécanismes non allergéniques Ozone (chien / rat Lewis Long Evans - serotonine IV  Wistar, Sprague-Dawley, Brown Norway, Fisher 344) Séphadex (rat: augm réactivité bronchique à la sérotonine IV/ eosino) Agonistes contractiles (LTD4, bradykinine, PAF-cobaye) Cytokines: cobaye - IL5 (eos), IL8 (TxA2) endotoxine: cobaye - HRB subst P

Modèles animaux d’hyperréactivité bronchique (3) Réponses des VA aux allergènes et hyperréactivité - modèles murins +++: OVA ip - 4 semaines - aerosol OVA histamine et serotonine ( homme) HRB variable A/J >>>C57BL/6J indépendant inflamm VA, eosino, IgE totales ou spécifiques HRB chez Balb/c sans eosino des VA - rat : OVA, TMA / HRB indépendant inflamm des VA et dissociation effet tt antiinflamm sur HRB et VA / NB:agonistes cholinergiques IV - cobaye : OVA, ac plicatique (cf cèdre rouge), toluène diisocyanate -

Modèle murin et génétique de l’hyperréactivité bronchique Intérêt du modèle murin Génome murin: marqueurs satellites permettant l ’identification de loci (d’intérêt physiologique)  gènes candidats (clonage positionnel…) Similarités génome humain et murin Connaissance de la réponse immunitaire chez la souris Souris KO ou surexprimant un gène cible

Cytokines et modèles murins d’asthme

Modèle murin d’asthme (BALB/c – OVA): hyperréactivité bronchique et cellules à mucus épithéliales (H Hirose et al, J Pharmacol Sci 2003,92:209 – 217)

Modèle de remodelage des voies aériennes in vivo chez le rat Palmans et al, Am J Resp Crit Care Med 2000; 161: 627-635

Effet de l’exposition allergénique répétée chez le rat Palmans et al, Am J Resp Crit Care Med 2000; 161: 627-635 concentration carbachol (mg/ml)

Cellules dendritiques, asthme et modèle murin GM-CSF

Augmentation du nombre de cellules dendritiques chez les souris BALB/c sensibilisées OVA stimulées par aérosol d’OVA vs PBS (B. N. Lambrecht, Allergy 2005: 60: 271–282)

L’administration intra-trachéale de CD stimulées par OVA à des souris ou des rats naïfs induit une forte réponse TH2 après exposition à un aérosol d’OVA (B. N. Lambrecht, Allergy 2005: 60: 271–282) Infiltration éosinophile, hyperplasie c. à mucus et HRB

La suppression des CD de souris allergiques à l’OVA (transgéniques: gène suicide des CD sous ganciclovir) lors de l’exposition allergénique fait disparaître l’inflammation des voies aériennes (B. N. Lambrecht, Allergy 2005: 60: 271–282)

Vaccination anti - IL-5 1993 : cobaye 2001: souris Vaccin actif souris sensib. OVA (A) et modèles d’asthme après transfert CD4+ (B)