DIAGNOSTIC MOLECULAIRE Diagnostic de sujets atteints : diagnostic de certitude Diagnostic chez les porteurs sains (maladies récessives) permet le conseil génétique diagnostic des femmes porteuses Diagnostic prénatal Diagnostic préimplantatoire Diagnostic prédictif

COMPLEXITE DU CHAMP D’APPLICATION Très nombreuses maladies génétiques – très nombreux gènes Phénotypes parfois mal définis Anomalies spécifiques d’une maladie – Stratégies d’étude spécifiques Capacité de réponse d’un patient à une molécule thérapeutique : Phamacogénétique

Méthodes utilisées pour le diagnostic génotypique DIAGNOSTIC DIRECT 1 – Recherche de mutations ponctuelles - mutation connue - screening d’un gène : séquençage, DHPLC, HRM 2 – Recherche d’amplifications de triplets 3 - Recherche de délétions DIAGNOSTIC INDIRECT

Dans un microtube : ADN à amplifier ou matrice : 50ng à 500ng les 2 amorces -dNTP -Taq Polymérase -tampon avec Mg++ Volume final : 20 l à 100 l Appareil : Thermocycler

1– recherche directe de la mutation déjà identifiée dans la famille   A – PCR - restriction

B – ASO Allele specific oligonucleotide 1 - PCR + DOT BLOT (dépôt sur membrane) 2 - hybridation par oligosondes spécifiques de la séquence normale de la séquence mutée

ASO

The line-probe assay (LiPA) Biotinilated primer

C – ARMS test ou allele specific PCR

- Chaque sonde spécifique doit avoir une taille différente D – test OLA PEO : Penthaethylene oxide units marquage fluorescent FAM HEX TET La sonde commune peut être marquée avec un fluochrome différent dans les PCR multiplex - Chaque sonde spécifique doit avoir une taille différente

Oligonucleotide ligation assay OLA Application de la technique OLA à la recherche des principales mutations du gène CFTR (mucoviscidose)

2 – recherche de mutations dans un gène : screening Séquençage DHPLC HRM

Séquençage (vecteur) 4 mélanges sont préparés: - le fragment qui doit être séquencé - un petit morceau d'ADN dont la séquence est complémentaire à l'extrémité 3' du fragment à séquencer = amorce - les 4 dNTP's (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) - l'ADN polymérase (vecteur)

L'utilisation d'un ddNTP permet d'obtenir un ensemble de fragments d'ADN de différentes tailles, correspondant aux emplacements d'un nucléotide donné exemple: synthèse du brin complémentaire, et arrêt aléatoire par un ddGTP quand il y a une Cytosine sur la séquence

Séquenceur à plaques

DHPLC Dans des conditions de dénaturation partielle, le temps de rétention sur colonne de chromatographie liquide est différent pour les homoduplexes et les hétéroduplexes.

HRM Après PCR en présence d’un intercalant fluorescent cette technique permet, en appliquant une montée en T° très progressive, de discriminer des variants. La dénaturation provoque la baisse de la fluorescence puis son extinction quand la dénaturation est complète. Chaque séquence a donc une courbe de fusion qui lui est propre. Une modification de cette courbe signale la présence d’une anomalie.

2 – Recherche d’amplifications de triplets Exemple du X Fragile - par PCR Possibilité d’amplifier jusqu’à 80 répétitions Hommes - si > 80répétitions = pas de signal femmes – un seul signal = sujet homozygote ou sujet présentant une mutation complète

EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI Par Southern blot EagI FMR1 (CGG)50 EagI FMR1 sonde EagI EcoRI EcoRI FMR1 (CGG)500 sonde

Coupure EcoRI + EagI et SOUTHERN BLOT PM PM MT MT MUTE PREMUTE X INACTIF 5,2 kb NORMAL X INACTIF PREMUTE X ACTIF 2,8 kb NORMAL X ACTIF

3- Recherche de délétions 2-1 Délétions de petite taille PCR simple ou multiplex Southern MLPA QMPSF 2-2 Délétions des télomères : MLPA 3-3 Délétions de grande taille : CGH array

- Par PCR

Recherche de délétions par PCR multiplex Exemple de la myopathie de Duchenne et de Becker

Diagnostic délétions : Myopathie de Duchenne

Détection de délétions par la technique de Southern

Multiplex PCR reaction : same stringent PCR conditions QMPSF Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescent Fragments stabilization Forward primer Reverse primer stabilization tail+6FAM Target specific sequences tail Primer design Multiplex PCR reaction : same stringent PCR conditions 1A 2A 1B 2B ZIC2 TGIF SIX3 SHH SHH Ctrl gene SHH SIX3 TGIF ZIC2 Control - Patient Control Patient Denaturation Target 1 fragment Target 2 fragment 1A 1B 2B 2A PCR Peak size normalization based on endogenous peak of control gene Visual analysis Fragment Analysis

MLPA (1) Multiplex Ligation dependant PCR Amplification Primer X Target specific Stuffer Primer Y binding site sequences sequence binding site Probe design Synthetic oligonucleotide M13 derived oligonucleotide 1A 2A 1B 2B Control Patient Target 1 1A 1B Multiplex hybridization and ligation No ligation of mismatched probes 2A Target 2 2B Peak size normalization Ratio = R = 1.5 duplication R = 1 normal R = 0.5 deletion PCR with universal primers X and Y No exponential amplification of non ligated probes X Y Patient peak Control peak Fragment Analysis

Délétions de grande taille CGH array

Délétion en 2q12.3 de 2,5 Mb

DIAGNOSTIC INDIRECT INDICATIONS - gène localisé dans le génome mais non cloné gène connu, mais mutation non identifiée exemple de la myopathie : recherche des filles vectrices délétion non détectable chez les filles (sauf PCRq) PRINCIPE identification du chromosome porteur du gène muté à l’aide de marqueurs polymorphiques situés à proximité du gène - liaison génétique CONTRAINTES - disposer d’un enfant atteint risque de recombinaison

Liaison génétique A1 A3 B2 B4 Gène N Gène M C2 C3 D4 D1 A1 B4 Gène M C3 D4

Marqueurs polymorphiques utilisés : microsatellites

Allèle 1 Allèle 2 1 -2 1 -2 2 -2 1 -1