PHARMACOGENETIQUE Jean Baptiste Woillard UMR Inserm S850 Pharmacologie, Toxicologie et Pharmacovigilance, CHU Limoges Pharmacologie médicale, Faculté de Médecine de Limoges No conflict of interest to declare

Définition et objectifs de la pharmacogénétique La pharmacogénétique étudie l’influence de la séquence d’ADN (variabilité génétique) sur la réponse aux médicaments : Explique une partie de la variabilité inter-individuelle : d’ordre pharmacocinétique : variations génétiques concernant l’expression ou l’activité des protéines impliquées dans le métabolisme ou le transport des médicaments d’ordre pharmacodynamique : variations concernant les gènes codant pour des récepteurs ou autres protéines cibles des M.

Définition et objectifs de la pharmacogénétique mettre au point des tests de dépistage génétique permettant d’identifier les sujets répondeurs et non répondeurs à un médicament donné Identifier les sujets à risque de survenue d’un événement indésirable pour un médicament donné Prévoir la dose la plus adaptée à chaque individu pour un médicament donné

Pharmacogénétique : une discipline récente ? Pythagore (510 av. J-C) à propos du favisme : « ce qui peut être nourriture pour certains, peut être poison violent pour d’autres » 1959, Friedrich Vogel définit le terme « pharmacogénétique  = bases héréditaires de la variabilité des effets des M. »

Favisme = déficit en glucose-6-phosphate deshydrogénase Médicaments Anti-paludéens (amino-8 quinoléine; quinine) Phénicolés Quinolones 1er gén. et Fluoroquinolones Sulfamides Vitamine C Sulfonamides Phénacétine Aliments Fèves Boisson contenant de la quinine (Schweppes, Tonics, Gini) G6PD Gluco-6-phosphate 6-phosphogluconate NADP+ NADPH Glutathion oxydé Glutathion réduit Glutathion reductase Déficit en G6PD EFFET ANTIOXYDANT POTENTIEL OXYDANT HEMOLYSE

Notions de génétique en pharmacogénétique Rappel de génétique moléculaire Le génome humain ~ 3 milliards de paires de bases 20 000 – 25 000 gènes 2% du génome codant pour des protéines Séquence comportant des variations génétiques ~ 10 millions de paires de base Un gène sur trois a des variations fréquentes

Polymorphismes génétiques Différence de la séquence d’ADN à une position donnée (gène), pour des individus d’une même espèce Un gène est dit polymorphe lorsqu'il existe, dans une population, sous plusieurs formes chez au moins 1% des individus. NB. Polymorphisme ≠ mutation Mutations (variations pathologiques) Rare (< 1%) Diagnostique de maladie génétique Implications physiopathologiques et/ou thérapeutiques Polymorphismes (variations neutres) > 1% de la population. Permet la cartographie physique du génome, l’identification des individus  susceptibilité individuelle aux médicaments

Polymorphismes génétiques Macrolésions Remaniement concernant l’intégralité du gène Fusion, duplication, ou délétion du gène Peu fréquent Exemple : duplication du cytochrome P450 2D6 ADN Gène « normal » CYP2D6*1 ou 2D6*2 Gène dupliqué CYP2D6*1x2 ou 2D6*2x2 aagggacta… ARNm aagggacta… aagggacta… Protéine

Polymorphismes génétiques Microlésions Remaniement concernant une à quelques bases nucléotidiques Trois types de microlésions : Insertion (ajout d’un à quelques nucléotides) Délétion (disparition d’un à quelques nucléotides) Substitution (Single Nucleotide Polymorphism : « SNP »)  Très fréquent (un SNP / 100 à 1000 paires de base soit au total, 11.8 millions de SNP référencés Conséquences variables Modification de la séquence protéique Modification de l’expression protéique

Fréquence (Caucasiens) Exemple : le CYP2D6 Allèle Variation Consequence activité Enzyme Fréquence (Caucasiens) *1 none - normal *2 2850 C>T; 4180G>C Arg296Cys; Ser486Thr 30 % *3 2549 delA Truncated protein aucune 2 % *4 1846 G>A Splicing defect 12-21 % *5 Deletion (11.5 Kb) Entire gene deletion 2-7 % *6 1707 delT 1 % *10 100 C>T Pro34Ser diminuée 1-2 % *41 -1584 G>C; 2988 G>A 10-20 % *1/2xN recombination Gene amplification augmentée 1-10 %

Les familles de gènes concernés Médicament Absorption Distribution PHARMACOCINETIQUE PHARMACODYNAMIE Métabolisme Elimination Enzymes, transporteurs Récepteurs, protéines, enzymes …

Applications cliniques Polymorphisme du CYP 3A5 (métabolisme du tacrolimus) : dose plus importante chez les expresseurs du CYP3A5 Polymorphisme du CYP 2C19 (métabolisme du clopidogrel et voriconazole) : 2-6 % des Caucasiens et 18-22 % des Asiatiques sont métaboliseurs lents DPD/5FU  ↗ toxicité du 5FU Si variants DPD Sim et al. 2011

Exemple : tacrolimus/CYP3A5 80 % des M. sont transformés par les mono-oxygénases hépatiques (dont les cytochromes P450) CYP3A5*3  protéine tronquée = non expresseur du CYP3A5 (=85% des caucasiens) Expresseur besoin d’une dose 2X pour atteindre le même C0 0.15 mg/kg b.i.d. vs 0.075 mg/kg b.i.d. Zheng et al CPT 2012 Thervet et al CPT 2010

Exemple : voriconazole/CYP2C19 CYP2C19*17  ↗ activitée CYP2C19 (augmentation de la transcription) CYP2C19*2 ↘ activitée CYP2C19 (défaut d’épissage) Lamoureux & Duflot, Woillard et al., Impact of CYP2C19 genetic polymorphisms on voriconazole dosing and exposure in invasive fungal infections (en révision dans International Journal of Antimicrobial Agents)

Exemple toxicogénétique

M6G effet analgesique identique mais effet depresseur respiratoire augmenté vs morpine

Glucuroconjugaison de l’irinotécan UGT1A1 : Déficit de glucuronoconjugaison (« Gilbert »)  Irinotécan Relling & Dervieux Nature Reviews Cancer 1, 99-108 (November 2001)

Application de l’analyse Pharmacogénétique Prospectif (ou rétrospectif)  Présence homozygote de l’allèle UGT 1A1*28 (TA7): exclusion des protocoles d’intensification de dose ou adaptation de posologie en fonction du degré de toxicité éventuellement changement de chimiothérapie (cas de toxicité sévère de grade III ou IV).

L’exemple de la 6-mercaptopurine dans le traitement d’une forme de leucémie chez l’enfant 6MP transformé en 6TGN responsable de effet et toxicité 6TGN désactivé par TPMT Déficit complet  tox hématologique fatale Polymorphismes génétiques et phénotypes d’activité de la TPMT

Conséquences des polymorphismes indésirables rapide Ann Biol Clin 2004, 62, Allorge et Loriot

Identification du phénotype Déterminer son génotype par techniques de génétique moléculaire Administrer des médicaments tests (spécifiques de l’isoforme)  doser le M. et son métabolite  calculer le rapport métabolique (concentration du métabolite/concentration du produit parent). Doser et adapter les thérapeutiques habituelles (attitude pragmatique) … si le risque vital n’est pas engagé.

Type d’études en pharmacogénétique Les approches gène(s) candidat(s) : hypothèse mécanistique impliquant le(s) gène(s) étudié(s) dans le phénotype d’intérêt. nombre de SNPs étudié limité étude par haplotype si les SNPs sont en déséquilibre de liaison Les approches pan-génomiques ou GWAS (Genome Wide Association Study) utilisation des puces à ADN ou NGS. s’intéressent à la variabilité de l’intégralité du génome, sans hypothèse biologique. grand nombre de polymorphismes testés  nombre de sujets suffisant pour garantir une puissance statistique correcte.

Conclusion « ce qu’il faut retenir » Polymorphismes génétique fréquents ≠ mutation Expliquent en partie la variabilité inter-individuelle Avant d’envisager un problème lié à un polymorphisme, rechercher la présence en réalisant un dosage d’une interaction médicamenteuse d’un problème d’observance ou d’absorption Nombreuses applications, le séquençage haut débit ouvrant la porte à de nouvelles identifications

Techniques de génétique moléculaire : la PCR « Réaction de Polymerase en chaine » Méthode permettant d’ « amplifier » une séquence d’ADN (séquence cible) Mis au point par Mullis en 1986 Base de l’ensemble des méthodes de génotypage Étape indispensable avant d’identifier un polymoprhisme par une méthode de : séquençage basée sur l’électrophorèse (PCR-RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism, SSCP = single strand conformation polymorphism …) en temps réel (génotypage et PCR simultané) : TaqMan®, SYBR®green …

Principe de la PCR TaqMan Réaction 1- dénaturation du double brin d’ADN 2- hybridation des amorces et des sondes Séquence cible 3- élongation et clivage des sondes Activité exonucléase de l’enzyme FLUORESCENCE émise lors du clivage de la sonde

Principe de la PCR TaqMan ALLELE SAUVAGE ALLELE MUTE Source Applied-Biosystems

Principe de la PCR TaqMan Fluorescences «FAM et VIC » Fluorescence «FAM » Homozygote sauvage Hétérozygote Fluorescence «VIC » Homozygote muté Contrôle négatif

Principe de la PCR TaqMan Lecture en point final Homozygotes mutés Hétéroozygotes Homozygotes sauvages Contrôles négatifs

Principe de l’analyse HRM « High Resolution Melting » « fusion haute résolution » : analyse de la courbe de désappariement (fusion) d’un échantillon d’ADN amplifié, à haute résolution. Technique récente d’analyse d’ADN génomique après amplification PCR Applications = recherche de polymorphismes génétiques inconnus ou génotypage (y compris pour les insertions/délétions et mutations combinés)

Principe de l’analyse HRM « High Resolution Melting » et génotypage Analyse des variations de Tm (« melting temperature » ou température de fusion) ADN avec polymorphisme ADN de référence Différence de Tm

Exemple de résultats (2) 3 CQI 1 non porteur (6/6) 1 hétérozygote (6/7) 1 homozygote (7/7) + 1 patient Résultat = 6/7 Résultat = 7/7 (Gilbert)