Fragments circulant de pro-peptide natriurétique de type B N-terminal dans le plasma de patients souffrant d’insuffisance cardiaque J.Y.Y. Foo, Y. Wan, B.L. Schulz, K. Kostner, J. Atherton, J. Cooper-White, G. Dimeski, et C. Punyadeera Octobre 2013 www.clinchem.org/content/59/10/1523.full © Copyright 2013 by the American Association for Clinical Chemistry

Introduction – problème clinique actuel Insuffisance cardiaque (IC) : un problème de santé global associé à de mauvais pronostics cliniques fardeau économique considérable à travers le monde Le peptide natriurétique de type B (BNP) ou le peptide proBNP N-terminal (NTproBNP) plasmique améliore la précision de diagnostic chez des patients chez lesquels une IC est suspectée Cependant, leur utilité dans le dépistage de populations asymptomatiques et à des fins de surveillance est limitée par la variabilité interindividuelle et la variation pour un même patient, et la présence de diverses formes du peptide NT-proBNP dans le sang

Objectifs de l’étude : Identifier et quantifier la principale forme de NT-proBNP circulant dans le plasma prélevé chez des patients souffrant d’IC Aider au développement d’une nouvelle génération de tests de diagnostic

Questions de recherche Quels sont les fragments circulant communs de NT-proBNP dans le sang de patients souffrant d’IC ? Est-ce que le NT-proBNP en circulation (c’est-à-dire dans le sang) est fragmenté ? Quel fragment devrait être la cible des dosages de NT-proBNP à des fins de nouveaux diagnostics ?

Matériel et méthodes Participants et prélèvement d’échantillons Tous les participants avaient plus de 18 ans et ont donné leur consentement éclairé 20 patients souffrant d’IC symptomatique ont été recrutés (classe fonctionnnelle III – IV selon la New York Heart Association (NYHA)) Des échantillons de sang ont été prélevés dans des tubes d’EDTA afin de minimiser la dégradation in-vitro de NT-proBNP, immédiatement centrifugés, séparés du plasma et stockés à -800C jusqu’à leur analyse Immunoprécipitation A été utilisée pour identifier les principaux produits protéolytiques de NTproBNP dans la circulation Le plasma des patients souffrant d’IC (n= 4) a été utilisé pour les réactions d’immunoprécipitation (IP)

Matériel et méthodes (suite) Immunoprécipitation et spectrométrie de masse Un anticorps monoclonal de NT-proBNP (ciblant les acides aminés 13–20) a été chimiquement couplé à Dynabeads® M-270 Epoxy (Invitrogen) en utilisant la chimie d’EDS-NHS [1-ethyl-3-(3 dimethylaminopropyl)-carboimide et N-hydroxysuccinimide] conformément aux instructions du fabricant, Le NT-proBNP plasmatique enrichi a été digéré avec de la trypsine dans 50 mmol/l de Tris-HCl pH 7,5 avec 10 mmol/l de dithiothréitol at 37°C pendant 16 h, dessalé par l’intermédiaire de C18 ZipTips (Millipore), et analysé par chromatographie liquide (CL)-ionisation par électronébulisation-spectrométrie de masse en tandem (SM/SM) en utilisant un système Prominence nanoLC (Shimadzu) sur un spectromètre de masse TripleTof 5600 avec une interface Nanospray III (AB SCIEX)

Matériel et méthodes (suite) Immunoprécipitation et spectrométrie de masse Les protéines ont été identifiées en utilisant le logiciel Protein Pilot (AB SCIEX), recherchant la base de données LudwigNR (à télécharger depuis http://www.wehi.edu.au/faculty/advanced_research_technologies/proteomics/wehi_systems_biology_mascot_server mis à jour le 27janvier 2012 ; 16 818 973 séquences ; 5 891 363 821 résidus) Des peptides identifiés avec une confiance de 99 % et avec un taux de faux local de 1% ont été inclus pour une analyse complémentaire, et des spectres de fragmentation par MS/MS ont été analysés manuellement Des chromatogrammes d’ions extraits ont été obtenus en utilisant PeakView 1.1

Sites de liaison d’anticorps sur les 6 fragments de NT-proBNP glycosylé 36 37 O-glycosylation 44 48 53 58 NH2 COOH 76 1 * Figure 1. Les 6 dosages immunologiques utilisent des anticorps monoclonaux de classe de diagnostic pour détecter NT-proBNP1-20, NT-proBNP13-45, NT-proBNP1-45, NT-proBNP28-76, NT-proBNP13-76 et NT-proBNP1-76. Les sites protéolytiques N- et C-terminaux détectés à partir de cette étude sont représentés par les lignes verticales rouges. * Paire d’anticorps qui donne la concentration de NT-proBNP la plus élevée.

Tableau 1 Tableau 1. Peptides NT-proBNP tryptiques et semitryptiques identifiés après immunoprécipitation (IP) à partir de plasma.

Proportion relative de peptides tryptiques et semitryptiques N- et C-terminaux provenant de NT-proBNP Figure 2. Proportion relative de peptides tryptiques et semitryptiques N- et C-terminaux provenant de NT-proBNP purifié par IP de patients individuels. (A) Peptides N-terminaux : bleu, H1-R21 ; rouge, L3-R21 ; vert, G4-R21 ; violet, G7-R21. (B) Peptides C-terminaux : orange, M67-R76 ; rose, M67-P75.

Fragments circulant de NT-proBNP dans le sang de patients souffrant d’IC (n=20). Figure 3. Les 25e, 50e (médian), 75e percentiles sont indiqués dans les tracés en rectangle et moustache. * Significativement différent de la concentration de NT-proBNP13–76 au taux P < 0,05.

Corrélation de NT-proBNP13-76 à NT-proBNP1-20 et NT-proBNP13-45 chez les patients souffrant d’IC Figure 4. La corrélation des rangs de Spearman est réalisée entre le taux de NT-proBNP13-76 et NT-proBNP1-20 (r de Spearman=0,890, p<0,0001) et NT-proBNP13-45 (r de Spearman=0,859, p<0,0001) dans le plasma.

Découvertes clés Les anticorps ciblant l’extrémité N-terminale donnent de faibles concentrations apparentes (1-76 vs 13-76 ; 1-45 vs 13-45). Les anticorps ciblant l’extrémité C-terminale donnent de faibles concentrations apparentes (1-76 vs 1-20). Les anticorps ciblant la région glycosylée donnent de faibles concentrations apparentes (1-45 vs 1-76) Conclusion NT-proBNP est tronqué de manière protéolytique aux deux extrémités N- et C terminales et est glycosylé dans sa région centrale. Pour un dosage immunologique optimal, les anticorps ne doivent pas cibler ces régions.

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