CHMI 4206 Bioinformatique appliquée Prof: Eric R. Gauthier, Ph.D. Département de chimie et biochimie Université Laurentienne Analyse comparative 1 – puces à ADN et à protéines CHMI 4206F - Automne 2010

Analyses comparatives Le but de ces analyses est d’obtenir une vue d’ensemble de plusieurs propriétés d’un organisme: Expression des gènes: puces à ADN SAGE Expression/modifications des protéines: puces à protéines Interactions protéines/protéines: Co-immunoprecipitation Système des deux hybrides de levures Inhibition ciblée de l’expression des gènes: Techniques d’interférence par l’ARN CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à ADN – « Microarray» Principe: hybridation d’ADNc (marqué avec une sonde fluorescente) sur une lamelle de microscope contenant une grille de plusieurs milliers de molécules d’ADNc (ou EST). CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à ADN – « Microarray» nature genetics supplement • volume 21 • january 1999 CHMI 4206F - Automne 2010

Préparation de l’échantillon Analyse avancée des données Hybridation Design de la puce Design de la sonde Question Design expérimental Achat de la puce Analyse statistique Calcul de l’index d’expression génique Analyse avancée des données Clustering PCA Classification Analyse de promoteurs Réseaux de régulation Données d’expression des gènes Normalisation Analyse de l’image CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à ADN – « Microarray» Current Opinion in Genetics & Development 1999, 9:715–722 CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à ADN – « Microarray» CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à ADN – « Stanford» Sondes (probes): - Longues: ADNc, produits de PCR - Courtes: oligonucléotides CHMI 4206F - Automne 2010

PCR amplification of target DNA Consolidate into plates (cDNA or portion of genomic DNA) Consolidate into plates Arrayed Library (96 or 384-well plates of bacterial glycerol stocks) Spot as microarray on glass slides CHMI 4206F - Automne 2010

Stanford microarrays DESIGN et SYNTHÈSE des SONDES SAMPLE CONTROL ARNm ADNc Cy3-ADNc Cy5-ADNc CHMI 4206F - Automne 2010

Transcription inverse et marquage Transcriptase inverse Amorce Oligo-T ADNc simple brin (antisense) Cy3 labeled Transcription inverse et marquage Transcriptase inverse Amorce Oligo-T dNTPs (Cy3 labeled) Isole ARNm de l’échantillon A Cy5 labeled Isole ARNm de l’échantillon B dNTPs (Cy5 labeled) AAAAA AAAAAA TTTTTT CHMI 4206F - Automne 2010

3’-CCCGGGTACGTAAATTCGTACCCTACGTA-5’ ADNc marqué 3’-CCCGGGTACGTAAATTCGTACCCTACGTA-5’ III III III III III III II II III III II II II II II II III III II II III III III II II III III II II 3’-CCCGGGTACGTAAATTCGTACCCTACGTA-5’ III III III III III III II II III III II II II II II II III III II II III III III II II III III II II 5’-GGGCCCATGCATTTAAGCATGGCATGCAT-3’ Spot CHMI 4206F - Automne 2010

Superpose les images et normalise excitation laser 1 laser 2 emission scanning Analyse Superpose les images et normalise http://www.stat.berkeley.edu/users/terry/zarray/Talks/image/1 CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à ADN – « Stanford » Forme « classique » Impression par technologie de jet d’encre Abordable pour la plupart des laboratoires (OCI: 40$ à 200$ par lamelle) Problèmes potentiels: Variabilité de la qualité de lamelle à lamelle Identité des ADNc CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à ADN « Stanford » Chaque une puce de type Stanford est scannée; L’intensité des spots est ainsi quantifiée: Intensité du signal Cy-3 (vert) Intensité du signal Cy-5 (rouge) Comme une sonde ADN différente est présente sur chaque spot, l’intensité de chaque spot nous donne la différence d’expression de chaque gène entre les deux conditions expérimentales testées. CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à ADN « Affimetrix » Très puissante haute qualité des grilles (synthèse in-situ par photolithographie) De courts oligonucléotides de 25 b de long sont synthétisés sur la lamelle Permet d’identifier des formes mutées ne différant que d’un seul nucléotide! TRÈS dispendieux… CHMI 4206F - Automne 2010

Photolithographie Mask #2 Mask #1 Synthèse in situ T A Mask #2 Mask #1 T A Spacers bound to surface with photolabile protection groups CHMI 4206F - Automne 2010

www.affymetrix.com CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à ADN « Affimetrix » CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à ADN – « Microarray» www.affymetrix.com - A C G T Nucléotide à la position corres- pondante sur la micropuce CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à ADN Design expérimental Deux approches expérimentales sont principalement utilisées: Approche locale: Ici, deux échantillons sont comparés afin de déterminer les différences d’expression de gènes entre deux conditions expérimentales différences (exemple: effet du choc thermique); Approche globale: Ici, plusieurs échantillons sont comparés les uns aux autres afin d’identifier des caractéristiques particulières: Gènes co-régulés Classification de tissus cancéreux CHMI 4206F - Automne 2010

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Puces à ADN Approche locale CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à ADN Analyse des données Cy3 Cy5 Expression augmentée vs Cy3 Expression augmentée vs Cy5 CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à ADN Clustering Utilisée dans l’approche globale d’analyse d’expression des gènes; Permet d’identifier des groupes de gènes qui sont co-régulés; Annu. Rev. Immunol. 2000. 18:829–859 CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à ADN – « Microarray» nature genetics supplement • volume 21 • january 1999 This map represents data from eight separate time series of gene expression in the yeast S. cerevisiae as indicated by the labels at the top of the figures: Alpha, CDC15 and Elu refer to observations of the mitotic cell cycle in cells synchronized by a factor arrest, by a conditional cdc15 mutation, or by centrifugal elutriation, respectively. SPO refers to a sporulation timecourse. H, D and C refer time courses of gene expression following heat shock, treatment with dithiothreitol and cold shock, respectively. DX indicates a series of observations during the diauxic shift8. CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à ADN « Microarray» 1 JANUARY 1999 VOL 283 SCIENCE CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à ADN Utilité dans la diagnostique Échantillons de biopsie de tumeurs Diffuse large-B cell lymphomas CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à protéines Ici, le but est de mettre en évidence des centaines voire des milliers de protéines en une seule expérience; Le principe de base est le même que celui des puces à ADN; Différentes saveurs existent, dépendamment du ligand fixé à la lamelle; CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à protéines CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à protéines e.g. Kinexus CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à protéines e.g. Kinexus CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à protéines e.g. Kinexus Duplicatats CHMI 4206F - Automne 2010

Puces à protéines e.g. Kinexus CHMI 4206F - Automne 2010

Analyse SAGE SAGE = Serial Analysis of Gene Expression Méthode non-biaisée permettant d’identifier les ARNm exprimés dans un tissu d’intérêt; Basée sur le séquençage en série de petits tags de 15pb dont la séquence est unique aux gène exprimant cette séquence; Identifie des séquences d’ARN correspondant à leur région 3’ non-traduite: diffère beaucoup même entre paralogues Avantages par rapport aux puces à ADN: Ne dépend pas de la connaissance préalable de la séquence à détecter; Permet de détecter des ARN inconnus jusqu’ici: Nouvelles formes provenant d’épissage alternatif Gènes inconnus CHMI 4206F - Automne 2010

Analyse SAGE Principe de base: 1) Utilisation de deux types d’enzymes de restriction de type II Reconnaissent une séquence d’ADN spécifique Coupent l’ADN directement sur la séquence reconnue Exemple: Nla III: coupe de la manière suivante: CATG GTAC + CHMI 4206F - Automne 2010

Analyse SAGE Principe de base: 2) Utilisation de deux types d’enzymes de restriction de type IIS Reconnaissent une séquence d’ADN spécifique Coupent l’ADN plusieurs paires de bases en 3’ de la séquence reconnue Exemple: BsmF1 GGGACXXXXXXXXXXXXXX CCCTGXXXXXXXXXXXXXX 10pb 14pb GGGACXXXXXXXXXX CHMI 4206F - Automne 2010

Analyse SAGE Principe de base: 3) Rétention de l’ADNc sur un support solide L’amorce utilisée pendant la transcription inverse de l’ARNm est couplée à une molécule de biotine; Sur des billes d’agarose, on a couplé plusieurs molécules de streptavidine: La streptavidine possède 4 sites de liaison pour la biotine; L’interaction biotine/streptavidine est parmi les plus fortes interactions non-covalentes impliquant les molécules biologiques (Kd = 10-14M) La biotine permettra donc de retenir l’ADNc sur la bille et de se débarrasser de séquences non désirables. CHMI 4206F - Automne 2010

Analyse SAGE Principe de base: 4) Utilisation de deux courtes séquences d’ADN appelées linkers: Possèdent un site de restriction pour NlaIII Possèdent un site de restriction pour BsmF1 Permettent de fournir une séquence qui sera ciblée pour l’amplification d’ADN par PCR. Chaque linker diffère de l’autre par cette séquence 5’AGGGCGCGATAAGGATTCGATCGATGGGACCATG3’ 3’TCCCGCGCTATTCCTAAGCTAGCTACCCTG5’ Séquence spécifique pour PCR Site BsmF1 Site NlaIII CHMI 4206F - Automne 2010

Analyse SAGE Biotine Bille de streptavidine Linker 1 Linker 2 CHMI 4206F - Automne 2010

Analyse SAGE Sites Nla III CHMI 4206F - Automne 2010

Analyse SAGE CHMI 4206F - Automne 2010

Analyse SAGE L’abondance des tags reflète les niveaux d’expression des gènes correspondant; Donc: la comparaison du nombre de copies des tags séquencées nous permet de détecter des différences dans l’expression de gènes entre deux échantillons. CHMI 4206F - Automne 2010

PCR quantitative Les données d’expression de gènes obtenues par puces à ADN ou SAGE doivent être confirmées avec une méthode indépendante. De plus les puces à ADN et la méthode SAGE n’ont qu’une valeur quantitative limitée. La confirmation de ces résultats, ainsi que la quantification de la différence d’expression de gènes, est généralement effectuée par PCR quantitative (Q-PCR, Real-time PCR); CHMI 4206F - Automne 2010

PCR conventionnelle Étape 1 Dénaturation Étape 2 1 copie 2 copies Étape 1 Dénaturation Étape 2 Hybridation de courtes amorces d’ADN Étape 3 Synthèse d’ADN à partir des amorces (polymérisation) CHMI 4206F - Automne 2010

PCR conventionnelle L’ADN de départ sert de modèle pour la synthèse de deux brins nouveaux; La quantité d’ADN ciblé par les amorces double donc à chaque cycle; On a alors une amplification de l’ADN ciblé par les amorces. Comme la quantité d’ADN augmente de manière exponentielle, de très petites quantités d’ADN de départ donneront lieu à de grandes quantité après 20 à 30 cycles d’amplification. CHMI 4206F - Automne 2010

PCR quantitative Une limite de la PCR conventionnelle est que l’ADN amplifié est analysé à la fin de la réaction, à un moment où le taux d’amplification a atteint un plateau: de petites différences dans les quantités de l’ADN de départ sont donc manquées. La PCR quantitative élimine ce problème de deux façons: L’amplification est détectée en temps réel; La quantification est réalisée dans la phase exponentielle d’amplification. CHMI 4206F - Automne 2010

PCR quantitative La sonde fluorescente SYBR Green est ajoutée au mélange réactionnel. SYBR Green ne fluoresce que suite à son incorporation entre les paires de bases; Donc: plus l’amplification progresse, plus le signal SYBR Green augmente; L’intensité du signal SYBR Green est détectée à chaque cycle, en temps réel par un détecteur faisant partie de l’appareil d’amplification (http://www.bio-rad.com/LifeScience/jobs/2005/05-0552/c4_tech.html) CHMI 4206F - Automne 2010

PCR quantitative Généralement, une courbe standard est préparée avec des quantités croissantes connues de l’ADN cible; On détermine alors le point d’intersection entre la pente de la partie linéaire d’amplification et le bruit de fond de fluorescence; Comme le nombre de cycle nécessaire pour obtenir un signal détectable est proportionnel à la quantité d’ADN de départ, on peut ainsi préparer une courbe standard du point d’intersection en fonction du nombre de copies d’ADN initiales. Les appareils actuels permettent l’amplification simultanée de dizaines d’échantillons, permettant la quantification de centaines d’échantillons par jour. CHMI 4206F - Automne 2010