Outils moléculaires du diagnostique hématologique et oncologique A. Galmiche février 2010

Introduction: intérêt de l’analyse des altérations génétiques en onco-hématologie Caryotype Hybridations: northern - southern, Hybridation in situ en Fluorescence (FISH), Puces PCR et PCR quantitative Hybridation génomique comparative CGH

Introduction: intérêt de l’analyse des altérations génétiques en onco-hématologie Caryotype Hybridations: northern - southern, Hybridation in situ en Fluorescence (FISH), Puces PCR et PCR quantitative Hybridation génomique comparative CGH

Généralités sur le Génome humain Génôme humain: 2 X 3 milliards de paires de bases Réparties sur 23 paires de chromosomes Environ 30000 gènes Les dérèglements d’expression de ces gènes jouent un rôle central dans pratiquement tous les aspects de la pathologie humaine

Génome et Cancer La cellule cancéreuse est caractérisée par instabilité génomique Gains et pertes de matériel génétique jouent un rôle moteur dans cancérogenèse Activation Oncogènes / perte de fonctions d’anti-oncogènes …. microlésions, délétions à l’origine de pertes d’hétérozygotie et perte de fonction d’anti-oncogènes… Amplifications, mutations, tranlocations peuvent activer des oncogènes …. Analyser le génome pour aider au diagnostic, suivre évolution et adapter traitement

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Le caryotype Réalisé à partir des chromosomes métaphasiques: Techniques de banding permettent observer chromosomes. Les chromosomes sont identifiés et classés suivant leur morphologie nb des chromosomes et ploidie, larges remaniements sont apparents

Cytogénétique et Cancer Cytogénétique permet « survol » du matériel génétique spécialement utile pour certaines hémopathies malignes comme la LMC Chromosome Philadelphie = translocation between chromosomes 9 and 22: t(9;22)(q34;q11) Réalise transcrit hybride Bcr-Abl possédant activité kinase dérégulée

Le caryotype permet une approche générale, à large échelle, du génôme Utile pour certaines anomalies équilibrées (qté du matériel génétique conservée) Mais n’offre qu’une approche grossière du génôme

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Les réactions d’Hybridation des acides nucléiques ADN: 2 brins anti-parallèles et complémentaires Appariements spécifiques: AT et GC Dénaturation, c’est à dire séparation de ces brins, est un mécanisme réversible… permet hybridations avec sondes Une sonde est un acide nucléique monobrin possédant séquence spécifique et rendue détectable par couplage avec un marquage Permet ainsi de détecter un acide nucléique

Les protocoles reposant sur l’Hybridation acide nucléique / sonde Blotting: pour ARN (Northern blot) et ADN (Southern blot). Après migration sur gel, les acides nucléiques sont transférés et immobilisés sur un support inerte (nitrocellulose / nylon) sur lequel on hybride la sonde Hybridation in situ: la distribution d’une séquence d’acide nucléique est analysée sur des cellules / des tissus fixés Puces ADN: cette fois, les sondes sont immobilisées sur support

Northern Blot

Northern blot (ARN) et Southern blot (ADN) sont des techniques historiques et relativement lourdes surtout utilisées en recherche, pas d’utilisation en routine En clinique, hybridation in situ pour l’essentiel (FISH)

Fluorescence in situ Hybridization (FISH) Les cellules ou le tissu à examiner sont fixés, et incubés en présence de la sonde, rendue fluorescente la sonde est détectée en microscopie FISH locus-spécifique (HER2, EGFR, myc) régions chromosomiques (chromosomal painting) La FISH permet donc d’accéder au génome à échelle microscopique Permet d’imager des remaniements fins du génome

Fluorescence in situ Hybridization (FISH) oncogène Her2 (rose), centromères du chromosome 17 (vert) FISH permet d’estimer d’estimer degré d’amplification de séquences d’oncogènes (Her2, EGFR, myc) Dans le cas du cancer du sein, technique utilisée en routine pour sa valeur pronostique et adapter traitement

FISH et mise en évidence remaniements équilibrés

Les „Puces“ Les puces reposent également sur le principe d‘hybridation Cette fois, une grande quantité de sondes immobilisées géométriquement sur un support inerte Les acides nucléiques à détecter sont marqués en fluorescence et sont mis à hybrider avec ces sondes

Principe du Microarray

Expression des Résultats Conditions expérimentales Liste des Gènes -> les résultats sont présentés par gène au moyen d’un code couleur: augmentation ou réduction d’expression du gène

Interprétation des Résultats Les puces ADN permettent d‘appréhender les régulations transcriptionnelles de façon globale Mais complexité des résultats obtenus: interprétation requiert analyse bioinformatique Les résultats obtenus sont validés grâce à des techniques plus quantitatives (PCR quantitative) Pour l‘instant du domaine de la recherche

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PCR (Polymerase Chain Reaction) La PCR, ou Polymerase Chain Reaction, est une réaction d‘amplification de l‘ADN in vitro La réaction comprend: ADN matrice à amplifier, 2 amorces spécifiques encadrant la séquence à amplifier, mélange deoxynucléotides (dNTPs), ADN polymerase dans conditions ioniques appropriées

Principe de la PCR

Les Cycles PCR La réaction est réalisée sur un thermocycler Une alternance de cycles comprenant chacun 3 étapes 1. dénaturation de la matrice: séparation des brins (95 °C) 2. hybridation amorces (env. 55-60 °C) 3. extension par ADN polymerase (70 °C) Typiquement, une amplification PCR comprend entre 20 et 30 cycles

Extrême sensibilité de la détection PCR: quelques copies d‘ADN sont détectables La PCR est une technique particulièrement appropriée à la détection de pathogènes bactériens / viraux: par rapport aux techniques comme les sérologies ou la culture, sensibilité et rapidité Permet également génotypages

PCR Quantitative - Principe Détection par fluorescence de la quantité d‘ADN amplifiée à chaque cycle de PCR. Par exemple, un agent fluorescent qui s‘incorpore à l‘ADN

Paramètre essentiel: Ct, cycle threshold Fluorescence / nombre de Cycles En phase exponentielle, quantification est possible: chaque cycle de PCR multiplie par 2 la qté d‘ADN Paramètre essentiel: Ct, cycle threshold

Principe de la RT-PCR DCt La RT-PCR permet la quantification relative de l‘expression des gènes (cette quantification devient absolue si les résultats sont normalisés par rapport à un contrôle interne, dont la concentration est connue)

Les Sondes Fluorescentes Spécifiques de Séquences La réaction PCR peut générer des produits non-spécifiques, voir irrelevants (dimeres de primers), en plus du produit désiré Pour une meilleure fiabilité de la quantification, il est possible d‘utiliser des systèmes permettant de ne mesurer en fluorescence que l‘amplification de séquences spécifiques En plus de constituer des systèmes spécifiques: couplage avec des fluorochromes différents, permettant alors de mener plusieurs amplifications simultanément dans un même tube: PCR multiplex

Génotypage rapide en PCR Quantitative Multiplex exons 1 2 3 4 6 7 8 9 10 11 Sujet sain Délétion à tester hétérozygotie

Applications Médicales Génotypage: détection d‘anomalies génétiques pouvant jouer un rôle dans pathologies génétiques ou cancer Diagnostic et suivi pathologies oncohématologiques: détection de cellules tumorales, maladie résiduelle après traitement et suivi récidives

Détection du remaniement BCR-ABL en PCR et suivi des LMC rechute Réponse au traitement

Introduction: intérêt de l’analyse des altérations génétiques en onco-hématologie Caryotype Hybridations: northern - southern, Hybridation in situ en Fluorescence (FISH), Puces PCR et PCR quantitative Hybridation génomique comparative CGH Séquençage

Principe de l’hybridation génomique comparative (CGH)

La CGH permet le diagnostic d’anomalies déséquilibrées Elle reste à ce jour du domaine de la recherche

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Mutations uniques peuvent aboutir à l’activation d’oncogènes KRAS, une petite protéine G impliquée dans la régulation de la croissance cellulaire, notamment en relai des récepteurs comme le récepteur de l’EGF Dans de nombreux cancers, mutation V12 réalise activation constitutive (40% des cancers colo-rectaux) Amplification PCR et séquençage exon 2 à la recherche de ces mutations Pour identifier ceux des patients chez lesquels mAb anti-EGFR a des chances d’être actif

CETUXIMAB EGF-R RAS RAF MEK