TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Francois HELLE

TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES But : - Mise en évidence des antigènes - Mise en évidence des anticorps

TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Mise en évidence des antigènes Où : - dans les cellules - dans les tissus - dans les liquides biologiques (sérum, LCR, urines…) Comment : au moyen d ’anticorps - polyclonaux - monoclonaux

TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Mise en évidence des anticorps Ou ? : - essentiellement dans le serum - plus rarement dans les autres liquides biologiques (LCR, salive…) Comment ? : au moyen d ’antigènes : - le germe lui-même - les antigènes - les tissus...

TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Choix de la technique : - Fonction de la concentration de l’antigène ou de l ’anticorps pg mg - Forme de l ’antigène (soluble ou particulaire) - Localisation de l ’antigène ou de l’anticorps

Production d’un anticorps monoclonal

Anticorps monoclonaux utilisés en thérapies anti-tumorales

Réaction Ag-Ac Interaction épitope-paratope Si l’antigène est moléculaire et soluble  complexe Ag-Ac forme un précipité Si l’antigène est particulaire ou cellulaire  complexe Ag-Ac forme un agglutinat

TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES 1- Précipitation 2- Agglutination 3- Utilisant un marqueur: -Immunofluorescence -Immunoenzymatique -Radioimmunologie (RIA) 4- Western-blot 5- Cytométrie en flux 6- Divers

TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES 1- Précipitation 2- Agglutination 3- Utilisant un marqueur: -Immunofluorescence -Immunoenzymatique -Radioimmunologie (RIA) 4- Western-blot 5- Cytométrie en flux 6- Divers

PRECIPITATION - Ag soluble + Ac correspondant - En milieu liquide ou en milieu gelifié - Lecture a l ’oeil nu ou avec un appareil (nephelomètre, turbidimètre) en moins d ’une heure a quelques jours - Peu sensible ( ~ mg)

Précipitation en milieu liquide = test de l’anneau Influencé par: - la T° - le pH - force ionique - adjuvants

Précipitation en milieu gélifié Gel d’agar ou d’agarose 1/Immunodiffusion double (Outcherlony) - Double diffusion Ag et Ac en fonction de leur PM - permet l’analyse qualitative d’un mélange d’Ag en solution

Méthode d’Outcherlony PRECIPITATION Reaction d’identite : 1-5 Reaction de non identite : 2-3 ; 4-5 Reaction d’identite partielle : 3-4

Méthode d’Outcherlony http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/ATP/immu2.htm Méthode d’Outcherlony Puits central :  sérum de lapin hyperimmunisé contre la sérumalbumine bovine (BSA) Puits périphériques :  1 : sérum de chèvre 2 : sérum de porc 3 : sérum de lapin 4 : sérum de bœuf 5 : sérum de cheval 6 : BSA Côté gauche Puits central :  sérum de lapin hyperimmunisé contre la sérumalbumine bovine (BSA) Puits périphériques :  solutions de BSA : 1 - 1 mg/mL 4 - 125 µg/mL 2 - 500 µg/mL 5 - 65 µg/mL 3 - 250 µg/mL 6 - 32,5 µg/mL Puits central :  sérum de lapin hyperimmunisé contre la sérumalbumine bovine (BSA) et l'ovalbumine de poule (OVA) Puits périphériques : 1 - OVA 4 - BSA 2 - MSA (souris) 5 - BSA 3 - MSA (souris) 6 - OVA 1 1 6 2 6 2 5 3 5 3 4 4

Précipitation en milieu gélifié 2/ Immunodiffusion radiale (méthode de Mancini) Technique quantitative qui permet le dosage d’un Ag (protéine)

Immunodiffusion radiale

Précipitation en milieu gélifié

Précipitation en milieu gélifié 3/ Electro-immunodiffusion (Laurell) Cette technique permet d’accélérer le temps de diffusion en obligeant l’Ag a migrer sous l’effet d’un champ électrique, dans un gel contenant l’Ac. Le pH du gel est choisi de façon que les Ac soient immobiles (pI des Ig) et que l’Ag chargé négativement migre (blocage des NH2 ; carbamylation, formylation).

Précipitation en milieu gélifié 4/ Immuno-électrophorèse Cette technique renforce le pouvoir analytique des doubles diffusions en identifiant les constituants d’un mélange par 2 propriétés indépendantes, leur mobilité électrophorétique et leur spécificité antigénique. 1er temps: mélange d’Ag est soumis à un champ électrique le long duquel les constituants se répartissent en fonction de leur mobilité electrophorétrique 2ème temps: un immunoserum polyspécifique diffuse dans un sens perpendiculaire à celui de la piste électrophorétique dont les fractions diffusent en sens inverse. L’exploitation des résultats est basée sur celle de la technique d’Ouchterlony

Immunoélectrophorèse Premier temps: Electrophorese Deuxieme temps:Immunodiffusion

Immunoélectrophorèse

Précipitation en milieu gélifié 5/ Immunofixation - séparation de la solution antigénique par électrophorèse - Ac spécifique est déposé - précipitation - coloration + sensible et plus rapide → Diagnostic des Ig monoclonales

Immunofixation PRECIPITATION ELECTROPHORESE IMMUNODIFFUSION

Immunofixation ALBUMINE Ig normales ALBUMINE Ig monoclonale

TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES 1- Précipitation 2- Agglutination 3- Utilisant un marqueur: -Immunofluorescence -Immunoenzymatique -Radioimmunologie (RIA) 4- Western-blot 5- Cytometrie en flux 6- Divers

AGGLUTINATION - Ag particulaire (bacteries, globules rouges) + Ac correspondant - Visible a l ’oeil nu - Quelques minutes - Plus sensible que la précipitation

AGGLUTINATION

AGGLUTINATION Parametres de réaction: il existe une relation entre l’agglutinabilité et : -le nombre de sites antigeniques -leur localisation

AGGLUTINATION Le titre agglutinant est l’inverse de la derniere dilution donnant une réaction positive Dilution au 1/4 → titre 4 Dilution au 1/8 → titre 8 ….

AGGLUTINATION ACTIVE Agglutination active Elle resulte d’une union specifique entre un Ac agglutinant et un Ag appartenant en propre a la particule. Elle peut se faire en tubes, en microplaques ou sur lame et peuvent etre: - qualitatives - quantitatives (la derniere dilution du serum ou l’on observe encore une agglutination). → Serogroupages bacteriens (Salmonella, Shigella, E. coli enterophathogenes…) → Groupage sanguin ABO

AGGLUTINATION ACTIVE

Quel groupes sanguins?

AGGLUTINATION PASSIVE Elle est realisee entre un Ac et un Ag normalement soluble, mais rendu particulaire par fixation sur un support : 1. Les billes de latex ; l’Ag est fixe par simple contact (pH 8,2) 2. Les hematies (HEMAGGLUTINATION) l’Ag est fixe par simple contact, par traitement a l’acide tannique, par fixation chimique (glutaraldehyde, di-nitro chloro-benzene…) ou par fixation immunologique (cas des Ac diriges contre des epitopes du GR).

AGGLUTINATION PASSIVE Inconvenients : - fragiles, elles s’hemolysent en 3 semaines (utilisation d’hematies formolees, stables plusieurs mois a 4°C) - elles portent une mosaique d’Ag → recherche du facteur rhumatoide (reaction de Waaler Rose → test de grossesse, detection de l’hormone gonadotrophine chorionique (HGC) dans l’urine ; GR recouverte d’hormone mise en contact des Ac anti-HGC et l’urine de la femme suspectee d’etre enceinte.

AGGLUTINATION PASSIVE Test de Coombs

Inhibition de l’hémagglutination passive (IHA) Permet de rechercher la présence d’un Ag dans un liquide biologique Ag fixé sur des hématies et mis en présence d’un antiserum specifique Si l’Ag est present il se combine aux Ac specifiques qui ne peuvent plus alors agglutinés les particules sensibilisées

TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES 1- Précipitation 2- Agglutination 3- Utilisant un marqueur: -Immunofluorescence -Immunoenzymatique -Radioimmunologie (RIA) 4- Western-blot 5- Cytometrie en flux 6- Divers

METHODES UTILISANT UN MARQUEUR - L ’immunofluorescence . Ag ou Ac marque avec un fluorochrome . Lecture au microscope a fluorescence ou cytometre en flux . Moins de 2 heures . Tres sensible (mg/mL pg/mL) - L ’immunoenzymologie (ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) . Ag ou Ac marque par une enzyme . Lecture au spectrophotometre . Moins d ’une heure a plusieurs heures . Tres sensible ( pg/mL) - Radioimmunologie: avec radioisotopes (125I) Le Western-Blot est egalement une technique immunoenzymatique

TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES 1- Précipitation 2- Agglutination 3- Utilisant un marqueur: -Immunofluorescence -Immunoenzymatique -Radioimmunologie (RIA) 4- Western-blot 5- Cytometrie en flux

Immunofluorescence L’immunofluorescence classique permet de déceler une réaction Ag /Ac sur des cellules en suspension, des frottis cellulaires, des microorganismes ou des coupes d’organe. 1/Indirecte (IFI): « methode en deux temps »

Immunofluorescence Fluorochromes: - FITC : dérivé de la fluorescéine (émission = 520 nm, couleur verte). - Rhodamine et ses dérivés, utilisé en général pour le double marquage, donne une fluorescence rouge-orangée. Applications: -Auto-immunité : détection des Ac antinucléaire, anti-organites ou Ac spécifiques d’organe. -Microbiologie : bactériologie, virologie (cinétique de multiplication de virus, détection de virus responsable d’infection respiratoire)…

Immunofluorescence ANCA

Immunofluorescence 2/ Directe Moins sensible Méthode en « un temps », l’Ag est recherché directement par l’Ac spécifique marqué. →Recherche des dépôts d’Ig ou de complément dans les tissus.

TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES 1- Précipitation 2- Agglutination 3- Utilisant un marqueur: -Immunofluorescence -Immunoenzymatique (ELISA) -Radioimmunologie (RIA) 4- Western-blot 5- Cytometrie en flux

ELISA Permet de doser n’importe quel antigene pour lequel on dispose d’Ac specifiques Tres grande sensibilité

IMMUNOENZYMOLOGIE (ELISA) 1/Principe Elles reposent sur l’utilisation d’une enzyme pour déceler les complexes immuns. Les techniques ELISA sont très utilisées en : -recherche fondamentale et appliquée (reconnaissance des épitopes protéiques, des haptènes) - analyse médicale, pour le dosage de nombreuses substances (Ag, Ac, hormones, marqueurs tumoraux, médicaments…) 2/Phase solide et fixation Par adsorption passive sur du verre, du plastique, du polystyrène, latex… sous forme de billes, de plaques, de tubes, de microplaques…

ELISA 3/ Enzyme Agent chimique utilisé pour coupler une enzyme à un Ag ou un Ac En fonction du substrat, le produit de la réaction est mesuré par spectrophotométrie, colorimétrie (examen visuel) ou par fluorométrie.

ELISA Dosage des antigenes: 1/Par competition: Vis à vis d’Ac présents en quantité limitée, et fixés sur un support, il y a compétition entre l’Ag à doser et l’Ag marqué (de même spécificité) ajouté en quantité définie dans le même temps.

ELISA 2/ Méthode en sandwich S’applique aux Ag possédant au moins 2 épitopes (identiques ou non). 100 fois plus sensible que la methode par competition

ELISA Dosage des anticorps: - Indirecte avec Ag marqué - Indirecte avec Ac secondaire marqué

ELISA Applications:  Dosage des protéines : la ß2m, drogues, hormones (insuline, glucacon…), médicaments, enzymes (énolase, lipase…), les facteurs rhumatoïdes, vitamines, IgE…  Diagnostic sérologique : parasitaire, bactériologique par titrage d’anticorps ( Brucella, Salmonelle, Treponema…), virologique (HIV,rubéole, hépatite A-B, varicelle, herpés, grippe…)  Maladies auto-immunes : recherche et dosage des FR, des Ac anti-ADN, anti-histones, anti-Dsg1/3…

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Radioimmunologie (RIA : Radio Immuno Assay) Méthodes utilisant un marqueur - Ag ou Ac marqué par un isotope - De moins en moins utilisée (déchets radioactifs, agrément)

TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES 1- Précipitation 2- Agglutination 3- Utilisant un marqueur: -Immunofluorescence -Immunoenzymatique -Radioimmunologie (RIA) 4- Western-blot 5- Cytometrie en flux 6- Divers

WESTERN-BLOT A/ Préparation des échantillons B/ Electrophorèse sur gel Appelé également immuno-empreinte ou immuno-transfert, immunoblot Cette technique combine le pouvoir de séparation de l’électrophorèse et la grande sensibilité de l’immunodétection, ce qui en fait un outil performant pour l’identification d’un Ag ou d’un Ac. Permet de détecter une protéine spécifique dans un échantillon donné Origine du nom:jeu de mots à partir du Southern Blot Différentes étapes: A/ Préparation des échantillons B/ Electrophorèse sur gel Séparation des Ag par SDS-PAGE Les protéines d’un extrait tissulaire ou cellulaire ou des protéines recombinantes dénaturées et chargées négativement, migrent dans un gel d’acrylamide / bis-acrylamide (de teneur x %) sous l’action d’un champ électrique. Elles sont séparées en fonction de leur PM

WESTERN-BLOT C. Le transfert des protéines sur membrane Les protéines contenues dans le gel sont transférées sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF sous l’action d’un champ électrique. D/ Blocage ou saturation de la membrane

WESTERN-BLOT E/Détection anticorps primaire et secondaire couplé à une enzyme le plus souvent -par colorimètrie -par chimiluminescence (la +sensible) -par autoradiographie -par fluorescence

WESTERN-BLOT La révélation immunologique

WESTERN BLOT VIH

TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES 1- Précipitation 2- Agglutination 3- Utilisant un marqueur: -Immunofluorescence -Immunoenzymatique -Radioimmunologie (RIA) 4- Western-blot 5- Cytometrie en flux 6- Divers

Cytométrie en flux Définition: étude précise de cellules isolées entraînes par un flux liquide Permet une caractérisation qualitative et quantitative des cellules Utilisation de fluorochromes (FITC,rhodamine)

Cytométrie en flux Principe: Les cellules sont canalisées par centrage hydrodynamique (passage une a une) dans une veine liquide traversée par un faisceau laser  Les cellules émettent des signaux lumineux, reflets de propriétés optiques intrinsèques ou induites des cellules Les signaux sont sépares (par des filtres optiques), collectes (par des photomultiplicateurs) puis amplifies Numérisation des signaux, traitement et stockage informatique des données representees sous forme d’histogrammes (1 paramètre) ou de cytogrammes (2 paramètres)

Méthode utilisant un marqueur Cytométrie en flux Méthode utilisant un marqueur

Cytométrie en flux

Cytométrie en flux

Cytométrie en flux Applications de la CMF: Purification des cellules CD34 pour la greffe de cellules souches hématopoiétiques Tri de cellules transfectées (utilisation conjointe du tri cellulaire et de gène rapporteur) Tri de spermatozoïdes (sélection du sexe d’un embryon) Tri de chromosome (création de banques) Tri des microorganismes de l’environnement (obtenir des souches pures d’algues unicellulaires par ex) Dénombrement de lymphocytes B, de lymphocytes T CD4+, CD8+… réalisée en diagnostic médical

Mesure de l’avidité des IgG Définition: force de liaison entre des Ag et les Ac correspondants Intérêt: aide a dater une infection Interprétation:

Mesure de l’index d’avidité

ELISPOT (« Enzyme-linked immunospot ») 1. Principe: Détecter et dénombrer les cellules T actives chez un patient, en détectant la sécrétion de cytokines (l’INFγ notamment). A l’origine, utilisée pour l’activation des cellules B En 1996, adaptée pour l’analyse de l’activation des lymphocytes T 2. La coopération cellulaire : cellule présentatrice d’Ag (CPA) / LT Test diagnostique de la tuberculose infection latente+++ (QuantiFERON-TB®)

ELISPOT

Evaluation d’une méthode La « sensibilité analytique » est la plus petite quantité de substance d'un échantillon qui peut être mesurée correctement par une technique. La « sensibilité diagnostique » est le pourcentage de personnes atteintes d'une maladie donnée qui sont identifiées par la technique comme porteur de cette maladie. Sensibilité=[Vrais positifs (VP)/[VP+ Faux négatifs (FN) ] ] La « spécificité analytique » se rapporte à la capacité d'une technique de mesurer un organisme ou une substance particulière, plutôt que d'autres, dans un échantillon La « spécificité diagnostique » est le pourcentage de personnes qui n'ont pas une maladie donnée et qui sont identifiés par la technique comme non porteur de cette maladie. Spécificité=[ Vrais négatifs (VN)/ [ VN+ Faux Positifs (FP) ] ]

Evaluation d’une méthode La valeur prédictive positive (VPP) d’un test diagnostique désigne la probabilité d'avoir une certaine maladie si on présente un test positif. VPP= [ VP/[VP+FP]] La valeur predictive négative (VPN) d’un test diagnostique désigne la probabilité ne pas avoir une certaine maladie si on ne présente un test négatif VPN= [ VN/[VN+FN]] La valeur globale (VG) d’un test diagnostique indique la proportion de résultats exacts donnés par ce test parmi l’ensemble de tous les résultats du test VG= [VP+VN/ [VP+VN+FP+FN] ]

Exercice Vous souhaitez évalué un nouveau test de dépistage du cancer du poumon. Ce test dose un marqueur par technique « ELISA sandwich ». L’échantillon étudié porte sur 400 patients suivis dans un service de pneumologie. Vous savez qu’il a été diagnostiqué auparavant 50 cancers dans cet échantillon. Le test est appliqué à l’ensemble de l’échantillon: 200 non malades ont eu un test négatif et 40 malades ont eu un test positif Calculer la sensibilité, spécificité, VPP, VPN et la valeur globale du test