EPIDEMIOLOGIE MOLECULAIRE DES INFECTIONS À PNEUMOCYSTIS JIROVECII

Historique Le genre Pneumocystis Détection de Pneumocystis Physiopathologie des infections à Pneumocystis Le réservoir de Pneumocystis La transmission de Pneumocystis Le polymorphisme génomique Etude de la transmission interhumaine en milieu hospitalier Etude de la transmission aérienne de P.jirovecii Etude de la transmission verticale Etude de la physiopathologie des infections par P.jirovecii Conclusion

Historique 1909: description par Carlos Chagas, cobaye Chagas, 1909 1910: description par Antonio Carini, rat Carini, 1911 1912: identification par Delanoë et Delanoë Delanoë, 1912  Pneumocystis carinii 1942: premier cas humain Van der Meer et al., 1942 1945-1955: nourrissons dénutris, prématurés Vanek et Jirovec., 1952, Gajdusek, 1957 pneumonies plasmocytaires 1955-1980: patients avec immunosuppresseurs Hamperl, 1956 1980: SIDA Masur et al., 1981 Aujourd’hui: SIDA + anti-rétroviraux Institut de veille sanitaire, 2007 autres causes d’immunodépression Sepkowitz et al., 1995 colonisation Morris 2008

Le genre Pneumocystis Groupe de micro-organismes eucaryotes Parasite du poumon de l’homme et d’autres mammifères Extra cellulaire, en contact avec pneumocytes de type I de l’alvéole pulmonaire Morphologie: trophozoïtes ou formes végétatives: 2 à 8 µm, mononuclés, amiboïdes, filopodes prékystes: 3 à 6 µm, mono puis multinucléés kystes matures: 4 à 6 µm, huit corps intrakystiques  trophozoïtes

Le genre Pneumocystis Stades morphologiques de Pneumocystis dans l'alvéole pulmonaire

Le genre Pneumocystis

Le genre Pneumocystis Cycle de multiplication de Pneumocystis jirovecii dans l’alvéole pulmonaire (seul lieu de multiplication connu) noyau voie asexuée mitochondrie prékyste précoce voie sexuée intermédiaire tardif kyste mature Formes trophiques Figure reproduite d’après Charles F. Thomas, Jr & Andrew H. Limper 2007 Nature Reviews Microbiology 5, 298-308.

Le genre Pneumocystis Protozoaires Caractéristiques morphologiques Sensibilité aux sulfamides Absence de développement sur milieu de Sabouraud

Le genre Pneumocystis Protozoaires Micromycètes Caractéristiques morphologiques Sensibilité aux sulfamides Absence de développement sur milieu de Sabouraud Micromycètes Etudes ultra-structurales: Matsumoto et al., 1991 absence d’organes de mobilité absence de complexe apical présence de (13) béta-D-glucane Etudes génomiques: similitude sur les gènes codant la petite sous-unité de l’ARN ribosomal Edman et al., 1988 l’ATPase Meade et al., 1995 la béta tubuline Edlind et al., 1992 la thymidilate synthétase Edman et al., 1989 la dihydrofolate réductase Edman et al., 1989 Proche des ascomycètes Eriksson, 1994 Champignon atypique

Le genre Pneumocystis Répandus chez les mammifères Héterogénéité inter-spécifique polymorphismes antigéniques Kovacs et al., 1989 caryotypiques Stringer et al., 1993 isoenzymatiques Mazars et al., 1997 génomiques Sinclair et al., 1991 impossibilité d’obtenir des infections croisées Soulez et al., 1991 Spécificité d’hôte 1994: nomenclature trinomiale: Pneumocystis carinii f. sp. hominis 2001: reconnaissance de différentes espèces: Pneumocystis jiroveci 2003: CINB, Pneumocystis jirovecii Infections à P.jirovecii = anthroponoses Pneumocystis jirovecii Pneumocystis carinii Pneumocystis oryctolagi Pneumocystis carinii Pr. O. Jirovec

Détection de Pneumocystis par microscopie Prélèvements: LBA +++ Examen direct: +++ May-Grünwald Giemsa Gomori-Grocott Bleu de toluidine Immunofluorescence Pas de culture Sérologie: pas d’intérêt

Détection de Pneumocystis par PCR Prélèvements: LBA, produits d’aspiration, expectorations, prélèvements non pulmonaires… Extraction de l ’ADN (automatisé Easymag©) Détection par nested-PCR gène de la mt LSU ARNr pAZ102-H & pAZ102-E Wakefield et al., 1990 pAZ102-X & pAZ102-Y Wakefield et al., 1996 Détection par PCR en temps réel technologie TaqMan® PCR externe  346 pb PCR interne  252 pb PCW3 sonde PCW4 ... 160 ACTATTTCTTAAAATAAATAATCAGACTATGTGCGATAAGGTAGATAGTCGAAAGGGAAACAGCCCAGAACAGTAATTAAAGCTCCCCAA ... quencher FAM ™ MGB

Pneumocystis = saprophyte des poumons Physiopathologie: anciens concepts Sujet sain portage pulmonaire chronique stades latents acquis durant l’enfance Immunodépression réactivation endogène des stades latents  PPC Données sérologiques acquisition d’anticorps anti-Pneumocystis durant les premières années de la vie  95% à 2 ans Meuwissen et al., 1977  66% à 4 ans Pifer et al., 1978 persistance des anticorps chez l ’adulte sain Peglow et al., 1990 Pneumocystis = saprophyte des poumons

Physiopathologie: concepts actuels Absence de Pneumocystis dans les poumons d ’individus IC asymptomatiques Millard et al., 1988 Peters et al., 1992 Disparition de Pneumocystis en 4 semaines après un épisode de PPC Roux et al., 1994 Épisodes récurrents dus à des génotypes différents Latouche et al., 1997 Keely et al., 1996 PPC infection de novo acquisition exogène de Pneumocystis

Physiopathologie: concepts actuels Primo-infection dans l’enfance Séroconversion Elimination spontanée du champignon, pas de portage chronique Persistance des anticorps Nouvelle contamination à partir d’une source exogène colonisation pneumonie à Pneumocystis = PPC (multiplication du champignon)

réservoir de P. jirovecii Source exogène de contamination: le réservoir de P. jirovecii Réservoir environnemental? Wakefield AE., 1996 Casanova-Cardiel et al., 1997 Etroite spécificité d ’hôte des espèces du genre Pneumocystis  exclue un réservoir animal pour P. jirovecii Mammifère = propre réservoir pour l ’espèce de Pneumocystis spécifique Homme infecté par P. jirovecii réservoir de P. jirovecii

Le réservoir de P. jirovecii Populations humaines infectées Patients avec PPC Patients colonisés Hauser et al., 2000 Nevez et al., 2003 Nourrissons développant une primo-infection Vargas et al., 2001 Nevez et al., 2001 Totet et al., 2003 Before talking about primary Pneumocystis infection, I would like to summarise new data and concepts on Pneumocystis epidemiology, Recent data point towards the potential for the specific host infected with Pneumocystis to serve as its own reservoir, and the potential for pneumocystosis in humans as an anthroponosis with humans as a reservoir for Pneumocystis jirovecii, P. jirovecii which is now the current name of the human-derived Pneumocystis. Thus, since individuals infected with P. jirovecii may act as potential infectious sources, it appears important to detect all populations infected with the fungus and particularly to detect infants at risk for primary Pneumocystis infection.

Le réservoir de P. jirovecii: les patients avec PPC Facteurs prédisposants Immunodépression acquise Déficit de l’immunité à médiation cellulaire +++ (lymphocytes CD4+) Patients infectés par le VIH (CD4+ < 200/mm3) Patients soumis à des traitements immunodépresseurs (CD4+ < 300/mm3) Immunodépression congénitale SCID Hypogammaglobuliémie Before talking about primary Pneumocystis infection, I would like to summarise new data and concepts on Pneumocystis epidemiology, Recent data point towards the potential for the specific host infected with Pneumocystis to serve as its own reservoir, and the potential for pneumocystosis in humans as an anthroponosis with humans as a reservoir for Pneumocystis jirovecii, P. jirovecii which is now the current name of the human-derived Pneumocystis. Thus, since individuals infected with P. jirovecii may act as potential infectious sources, it appears important to detect all populations infected with the fungus and particularly to detect infants at risk for primary Pneumocystis infection.

Le réservoir de P. jirovecii: les patients avec PPC Signes fonctionnels Dyspnée +++, toux, fièvre Début insidieux Signes cliniques Auscultation normale Radiographie pulmonaire Syndrome alvéolo-interstitiel bilatéral Before talking about primary Pneumocystis infection, I would like to summarise new data and concepts on Pneumocystis epidemiology, Recent data point towards the potential for the specific host infected with Pneumocystis to serve as its own reservoir, and the potential for pneumocystosis in humans as an anthroponosis with humans as a reservoir for Pneumocystis jirovecii, P. jirovecii which is now the current name of the human-derived Pneumocystis. Thus, since individuals infected with P. jirovecii may act as potential infectious sources, it appears important to detect all populations infected with the fungus and particularly to detect infants at risk for primary Pneumocystis infection.

Le réservoir de P. jirovecii: colonisation, primo-infection Patients présentant une colonisation pulmonaire par P. jirovecii Immunodépression modérée et/ou maladie broncho-pulmonaire Greffe rénale, cancers, maladies de système BPCO (16%) Rôle de P. jirovecii mal connu Nourrissons immunocompétents non prématurés, primo-infection Contacts avec P. jirovecii fréquents et précoces (données sérologiques) asymptomatique Vargas et al., 2001 Nourrissons hospitalisés pour bronchiolite (20%) Nevez et al., 2001 Nombreuses populations d ’individus infectés par P. jirovecii Diverses présentations cliniques des infections à P. jirovecii

Transmission de P. jirovecii Modèles animaux transmission directe par voie aérienne entre 2 hôtes de la même espèce Hughes et al., 1983 Soulez et al., 1991 Céré et al., 1997 Homme: transmission directe? évoquée sur les cas groupés Latouche et al., 1997 Helweg-Larsen et al., 1998 Olsson et al., 2001 Manoloff et al., 2003 Transmission aérienne d’un stade infectieux non connu Transmission possible entre les différentes populations de patients? Réservoir unique? Etude du polymorphisme génomique (identification infra-spécifique)

Polymorphisme génomique de Pneumocystis jirovecii mtLSU ARNr Latouche et al., 1997; Tsolaki et al., 1998 mtSSU ARNr Hunter et al., 1996 SOD-A Denis et al., 2000 DHPS Lane et al., 1997 DHFR Nahimana et al., 2003 ITS 1 et 2 +++ Tsolaki et al., 1998; Lee et al., 1998 Génotypes de P. jirovecii rapportés patients immunodéprimés avec PPC +++ patients colonisés par P. jirovecii Hauser et al., 2000; Nevez et al., 2003 nourrissons avec primo-infection Totet et al., 2003 et 2004

Polymorphisme des séquences ITS 1 et 2

Polymorphisme des séquences ITS 1 et 2 nested-PCR ITS clonage séquençage Score défini par Tsolaki et al. Allèles Position des nucléotides ITS 1 2 16 74-75 111-113 A2 C T - - TTA A3 T A - - TTA B1 T T AG TTA B2 T A AG TTA B3 C T AG TTA C T T AG - - - Allèles Position des nucléotides ITS 2 54-56 63 67-71 122 169-172 176 a1 TAA - AATAT - - - - - G a2 TAA - AATAA - - - - - G a3 TAA - AATAA - - - - - A a4 TAA - AATAT - - - - - A b1 TAA - AATAT - - - AT G b2 TAA - AATAT C - - AT G c1 - - - A - - - - - - - - - - A c2 - - - A - - - - - - - - - - G d TAA - AATAT - ATAT G J Clin Microbiol 1998 Génotypage de Pneumocystis jirovecii   score de Tsolaki et al. score de Lee et al.

Polymorphisme des séquences ITS 1 et 2 Score défini par Lee et al. Allèles Position des nucléotides ITS 1 6 12 15 21 23-24 28 34 42 53-54 80-81 115-119 A C T A T -- T T T -- -- TTTA B C - A T -- T T T -- -- TTTA C C - A T -- T T T -- AG TTTA D C T A T -- T T T -- AG TTTA E T - A T -- T T T -- AG TTTA F T - A T -- T T T -- AG TTTA G T - A T -- T T T -- -- TTTA H T - A T -- C T T -- AG TTTA I T - A T TT C T T -- AG TTTA J T - C T -- C T T AT AG TTTA K T - C T -- C T T -- AG TTTA L T - A T -- T C T -- AG TTTA M T - A T -- T T C -- AG TTTA N T - A A -- T T T -- AG TTTA O T T A T -- T T T -- AG TTTA J Clin Microbiol 1998

Polymorphisme des séquences ITS 1 et 2 Score défini par Lee et al. Allèles Position des nucléotides ITS 2 48-49 52-57 62-66 68-72 76 122 160 166-171 173 177-184  a - - TAA- - - AA-TA AATAT - - G ATATAT G - - - - - - - - b - - TAA- - - AA-TA AATAT - - G AT- - AT G - - - - - - - - c - - TAA- - - AA-TA AATAT - C G AT- - AT G - - - - - - - - d - - TAA- - - AA-TA AATAT - C T AT- - AT G - - - - - - - - e - - TAA- - - AA-TA AATAT - - G - - - - AT G - - - - - - - - f - - TAA- - - AA-TA AATAT T - G - - - - AT A - - - - - - - - g - - TAA- - - AA-TA AATAA - - G - - - - AT A - - - - - - - - h - - TAA- - - AA-TA AATAT - - G - - - - AT A - - - - - - - - i - - - - - - - - - - - - - AATAA - - G - - - - AT A - - - - - - - - j - - - - - - - - - - - - - AATAA - - G - - - - AT G - - - - - - - - k - - - - - - - - - - - - - AATAA - - G - - - - AT A CAAAATAC l - - - - - - - - AAATA - - - - - - - G - - - - AT A - - - - - - - - m - - TAATAA AA-TA AATAA - - G - - - - AT A CAAAATAC n - - TAA - TA AA-TA AATAT - - G - - - - - - A - - - - - - - - J Clin Microbiol 1998

Polymorphisme sur les gènes des enzymes cibles Bactrim® Fansidar® Indeed, sero-epidemiological surveys conducted in the 70’s indicated that humans commonly develop a primary Pneumocystis infection early in life. However in these studies, no microbiological data are available. Later, in the 90’s investigations showed that P. jirovecii was detectable by PCR in nasopharyngeal aspirates from leukaemic infants developing Pneumocystis pneumonia. In this context, our objectives were to obtain microbiological data in infants with no immunosuppression at risk for primary Pneumocystis infection.

Figure d’après Totet et al., Emerg Infect Dis, 2004 Polymorphisme sur le locus de la DHPS Locus DHPS: domaine D du gène Fas Mutations 165, 171 du locus de la DHPS  4 génotypes Echec de la prophylaxie ? Nahimana et al. 2003 Echec du traitement ? Mei et al., 1998 Helweg-Larsen et al., 1999 Navin et al., 2001 Facteurs de risque d’acquisition d’une souche mutante DHPS Antécédents de traitement par sulfamides Ville de résidence du patient Huang et al., 2000 Kazanjian et al., 2000 Figure d’après Totet et al., Emerg Infect Dis, 2004 Fas A Fas B Fas C Fas D s165 / s171 s165 / m171 m165 / s171 m165 / m171

Génotypage de Pneumocystis jirovecii Polymorphisme sur le locus de la DHPS PCR-RFLP Acc I Hae III G T C T A…G G C C T nested-PCR DHPS digestion migration Génotypage de Pneumocystis jirovecii Diop Santos et al., 1999

Polymorphisme sur le gène de la DHFR Données rares Ma et al., 1999 Takahashi et al.,2002 Nahimana et al., 2004 Lien entre mutations et échec de la prophylaxie Nahimana et al., 2004 Rôle de la pyriméthamine / triméthoprime ? Nahimana et al., 2004 Aucune donnée Facteurs de risque d’acquisition d’une souche mutante DHFR Lien entre mutations et échec du traitement Présence de mutations dans les autres formes cliniques de l’infection Colonisation pulmonaire Primo-infection

Polymorphisme sur le gène de la DHFR Amplification du gène de la DHFR PCR simple (amorces FR 1038 et FR 208) Nested-PCR (amorces FR 1018 et FR 242) Séquençage For the ITS genotyping, we worked on the 45 specimens mentioned above. The genotyping was based on analysis of ITS 1 and 2 sequences after amplification, cloning and sequencing. The genotypes identified were compared with those previously described in reports concerning adult patients with PCP. PCR simple Nested PCR

Etude de la transmission interhumaine en milieu hospitalier Cas groupés de PPC chez des patients transplantés rénaux : génotypage combinés à l’analyse des contages entre patients Rabodonirona 2004, Hocker 2005, De Boer 2007, Schmodt 2008, Yasaki 2009, Gianella 2010 Hypothèse d’acquisition et de transmission nosocomiale 2008-2009 étude de cas groupés chez 19 transplantés rénaux hôpital d’Amiens : 12 PPC / 7 colonisations Thèse B. Bergues, 2010 Etude des génotypes ITS et DHPS Carte de transmission pour étudier contacts potentiels entre les patients PPC et colonisés

Etude de la transmission interhumaine en milieu hospitalier Identité génotypique de P.jirovecii dans une série de cas groupés en milieu hospitalier  notion de transmission interhumaine et d’acquisition nosocomiale confortée   Rôle des patients colonisés dans la transmission du champignon en milieu hospitalier Prévention de l’apparition de nouveaux cas groupés justifie le dépistage des patients colonisés  Agir sur la globalité du réservoir humain de P. jirovecii

Etude de la transmission aérienne de P.jirovecii Détection de P.jirovecii par PCR Dans l’air de la chambre des patients avec une PPC Bartlett et al. 1997, Olsson et al. 1998 Dans le système de ventilation d’un patient avec une PPC Sing et al. 1999  Exhalation de P.jirovecii dans l’environnement aérien

Etude de la transmission aérienne de P.jirovecii Etude la transmission interhumaine par voie aérienne du champignon dans l’environnement hospitalier à partir des sujets infectés Identification génotypique des isolats de P.jirovecii provenant de : 15 prélèvements respiratoires de patients présentant une PPC 15 prélèvements d’air environnant ces patients Analyse des séquences des ITS et du locus de la DHPS M2 C.Damiani, 2010

Patient Air Génotype ITS Génotype DHPS P2 A2 Ih Eg - P4 A4 Gg S165 / S171 P5 A5 Ec P6 A6 S165 / M171 P7 A7 P8 A8 P10 A10 Be M165 / S171 P11 A11 P15 A15 Bl

Etude de la transmission aérienne de P.jirovecii L’identité génotypique renforce les notions de transmission interhumaine transmission par voie aérienne PPC = maladie nosocomiale circulation de souches mutantes et potentiellement résistantes au traitement dans l’environnement hospitalier mesures de prévention primaires adaptées au risque nosocomial = isolement des patients infectés

Etude de la transmission verticale Chez l’animal Etude de la transmissibilité in utero chez le lapin  PPC spontanée bénigne au moment du sevrage Pneumocystis dans les poumons de fœtus, le placenta et le liquide amniotique de lapines Ceré et al. 1997 Détection de l'ADN de Pneumocystis dans des poumons de fœtus de lapins Sanchez et al. 2007

Chez l’Homme Chez l'Homme, présence de kystes de P.jirovecii dans les poumons de fœtus mort-nés et dans le placenta de mères infectées Pavlica et al 1962, Bazaz et al. 1970, Mortier et al. 1995 20 poumons fœtus mort-nés / 20 placentas  ADN de P.jirovecii détecté par PCR dans 35% des poumons fœtaux et 5% des placentas Montes-Cano et al. 2009 Etude à Amiens : 49 poumons fœtus mort-nés / 49 placentas de 2008 à 2010  ADN de P.jirovecii détecté par PCR en temps réel sur 5/49 poumons fœtaux et 4/49 placentas Master 1 E. Fortes-Lopes, 2010  Rôle potentiel de Pneumocystis dans l'avortement spontané?

Etude de la physiopathologie des infections par P.jirovecii Figure reproduite d’après Prof H.Yamaguchi, School of Medecine, Teikyo University Etude de la physiopathologie des infections par P.jirovecii (13) Beta-D-glucane

Etude de la physiopathologie des infections par P.jirovecii Dosage du BDG sérique possible : kit commercialisé (Fungitell©) Marqueur diagnostique précoce des IFI (PPC, API, candidose invasive) Non spécifique (tous sauf zygomycètes et cryptocoques) Excellente VPN Diminution du taux de BDG sous traitement antifongique

Etude de la physiopathologie des infections par P.jirovecii Dosage sérique du BDG : principe Activation de la cascade de coagulation du limule = arthropode marin dont le sang coagule en présence d’endotoxines bactériennes

Etude de la physiopathologie des infections par P.jirovecii Causes de FP : Compresses de gazes/interventions chirurgicales Kanamori et al. 2009 Membranes de cellulose/hémodialyse Ostrosky-Zeichner et al. 1995 Bactériémie Pickering et al. 2005 Immunothérapies, antibiothérapies Kedzierska et al. 2007

Etude de la physiopathologie des infections par P.jirovecii PPC : BDG éliminé de la paroi des kystes  alvéoles pulmonaires  circulation générale via les capillaires pulmonaires Yasuoka et al. 1996 Intérêts BDG = marqueur non invasif utile pour diagnostic précoce des PPC surveillance du traitement diagnostic différentiel entre PPC et colonisations Rappel : Seule la paroi des kystes est pourvue de (13) β-D-glucane (BDG) Pas de BDG dans les formes trophiques

Etude de la physiopathologie des infections par P.jirovecii Taux sériques de BDG élevés dans les PPC Persat et al. 2008, Nakamura et al. 2009 Taux sériques de BDG indétectables dans le sérum des colonisés Shimizu et al. 2009 Taux sériques BDG PPC > BDG primo-infections > BDG colonisation Damiani et al, 2011  Présence de kystes de P. jirovecii dans les poumons des nourrissons avec primo-infection comme chez les PPC, avec une charge fongique toutefois plus limitée

Etude de la physiopathologie des infections par P.jirovecii Hypothèse : Reproduction essentiellement asexuée dans les colonisations au cours desquelles les kystes rares / absents noyau voie asexuée mitochondrie prékyste précoce voie sexuée intermédiaire tardif kyste mature Formes trophiques

Conclusion Epidémiologie moléculaire des infections à P. jirovecii communauté génotypique Totet et al. J Eukaryot Microbiol, 2001 nourrissons immunocompétents Totet et al. J Clin Microbiol, 2003 patients immunodéprimés Totet et al. Emerg Infect Dis, 2004 patients colonisés par P. jirovecii Nevez et al. J Clin Microbiol, 2003 Unicité du réservoir humain de P. jirovecii Maladie nosocomiale Nevez et al. Parasite 2008 Nouvelles populations de patients au sein de ce réservoir : transmission verticale Circulation de P. jirovecii dans l’air environnant les patients infectés Choukri et al. CID,2010 et JID 2011 Comprendre la physiopathologie des infections à P.jirovecii Damiani et al. JCM, 2011