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Définition de la Biotechnologie

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Présentation au sujet: "Définition de la Biotechnologie"— Transcription de la présentation:

1 Définition de la Biotechnologie
4 32 Définition de la Biotechnologie L’utilisation d’organismes, de cultures tissulaires, de cellules vivantes ou d’enzymes cellulaires pour fabriquer un produit défini.

2 5 32 Biothérapie Définition : Utilisation des produits de biotechnologie pour le diagnostic ou le traitement des maladies Corriger les déficits de substances endogènes Stimuler les processus physiologiques naturels Bloquer les protéines ou les acides nucléiques non fonctionnels Source: Evens, R. P., Witcher, M., Therapeutic Drug Monitoring 1993; 15:

3 Evolution de la Biotechnologie
6 Evolution de la Biotechnologie Approbation de l’insuline recombinante Découverte de la structure de l’ADN Petites molécules Chimie combinatoire Génomique A T Produits biologiques approuvés pour l’utilisation clinique C G T G A T Clonage de l’ADN T A C G T A Production d’anticorps monoclonaux G C G C T G C T A A T Identification du code génétique G T A A T T A C G G C Clonage d’un gène humain Thérapie génique Introduction de la PCR 1953 ’61–’65 ’73 ’75 ’77 ’82 ’86 Fin des années 80 et 90

4 Impact de la Biotechnologie sur la société
Médical Recherche Agriculture Environnement Industrie

5 3 MILLIARDS de paires de nucléotides
Chromosomes, Gènes, ADN 1 Cellule humaine et noyau 3 MILLIARDS de paires de nucléotides 46 Chromosomes – 23 maternels, 23 paternels – Femmes : XX – Hommes : XY à gènes

6 Le principe fondamental : L’ADN fabrique l’ARN qui synthétise la protéine
12 Traduction Transcription Protéine Protéine complète Ribosome Acides aminés Glycosylation Pliage Cross-linking ADN cellulaire ARNm Noyau ARNt Sécrétion

7 Le code génétique ARNm TRADUCTION Protéine IIe Arg IIe Arg Asp Asn Gly
UUU Phe UCU Ser UUC Phe UCC Ser UUA Leu UCA Ser UUG Leu UCG Ser CUU Leu CCU Pro CUC Leu CCC Pro CUA Leu CCA Pro CUG Leu CCG Pro AUU Ile ACU Thr AUC Ile ACC Thr AUA Ile ACA Thr AUG Met ACG Thr GUU Val GCU Ala GUC Val GCC Ala GUA Val GCA Ala GUG Val GCG Ala UAU Tyr UGU Cys UAC Tyr UGC Cys UAA Stop UGA Stop UAG Stop UGG Trp CAU His CGU Arg CAC His CGC Arg CAA Gln CGA Arg CAG Gln CGG Arg AAU Asn AGU Ser AAC Asn AGC Ser AAA Lys AGA Arg AAG Lys AGG Arg GAU Asp GGU Gly GAC Asp GGC Gly GAA Glu GGA Gly GAG Glu GGG Gly IIe Arg IIe Arg Asp Asn Gly Arg ARNm TRADUCTION Protéine

8 Introns et Exons dans la transcription des gènes
13 Chromosome “Gène” sur le chromosome (ADN) Transcription pré-ARNm Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2 Exon 3 Splicéosome Séquence de terminaison ARNm Séquence de tête Traduction Protéine

9 Principales techniques de la Biotechnologie
15 32 Technologie de l’ADN recombinant Anticorps monoclonaux Blocage des nucléotides (anti-sens) Thérapie génique Amplification en chaîne par polymérase PCR Chimie combinatoire Modelage moléculaire Chimie des hydrates de carbone Génomique Chimie des petites molécules

10 Outils de la technologie de l’ADN recombinant
16 1. Isolement 2. Clonage 3. Production du gène et expression de protéines Gène Transcriptase inverse Polymérase Sonde d’ADN Plasmide Clones Enzymes de restriction Milieux de culture Ligase Fermenteur Promoteur/amplificateur Flacons cylindriques Lieur (DNA linker) Chromatographe Cellule hôte

11 Ex. de digestion par EcoRI
Endonucléases de restriction : Des enzymes qui coupent l’ADN au niveau de sites spécifiques 17 12A Origine de l’enzyme Nom de l’enzyme Site de coupure par l’enzyme Ex. de digestion par EcoRI G A A T T C Escherichia coli EcoRI C T T A A G G C T A G G C C Haemophilus aegyptius Hae III Eco RI Eco RI C C G G T C G A G C T A Thermus aquaticus Tag I A G C T C T N A G Desulfovibrio desulfuricans Dde I G A N T C C T G C A G Providencia stuarti Pst I G A C G T C C C T N A G G Microcoleus stuarti Mst II G G A N T C

12 Plasmides : Vecteurs pour le clonage et l’expression des gènes
18 12B Polylieur EcoRI Hind II Sma II Pst I Site de clonage Résistance à l’ampicilline Bam HI Résistance à la tétracycline Opérateur Origine Promoteur

13 Etape 1 : Isolement du gène
19 Etape 1 : Isolement du gène Protéine Séquençage des acides aminés Option 1 Synthèse de l’ADN Transcriptase inverse Option 2 ADN ARNm Gène souhaité Bibliothèque génomique Option 3 Sonde d’ADN

14 Etape 2 : Clonage et Expression
20 Etape 2 : Clonage et Expression 1. Gène souhaité incorporé dans le vecteur Amplificateur/promoteur Enzymes de restriction ADN ligase Lien d’ADN Plasmides 2. Transfert du vecteur dans la cellule-hôte Gène Protéine souhaitée 3. Clonage/expression de la protéine souhaitée

15 Etape 3 : Production de protéine Cellules de Mammifère
21 15D Inoculat Banque cellulaire Flacon agitateur Fermenteur Flacon en T Flacons cylindriques d’inoculat Culture cellulaire Flacon cylindrique Phase de croissance Cycle 1 de production Cycle 2 de production Concentration/diafiltration Protéine brute en vrac Changement de milieu Changement de milieu Récolte 2 Récolte 1 Purification Protéine brute décongelée Chromatographie sur colonne Filtration stérile Protéine purifiée en vrac Formulation Galénique Ampoules prêtes à l’emploi Protéine purifiée en vrac Tampon et stabilisateurs

16 Etape 3 : Production de protéine Souche microbienne
22 15D Inoculat Fermenteur Inoculat Banque cellulaire Flacon agitateur Flacon en T Cycle 1 de production Cycle 2 de production Pâte cellulaire brute en vrac Culture cellulaire Centrifugation Changement de milieu Changement de milieu Purification Destruction des cellules Destruction Des vacuoles Chromatographie sur colonne Filtration stérile Pâte cellulaire brute en vrac Protéine purifiée en vrac Formulation Galénique Protéine purifiée en vrac Tampon et stabilisateurs Ampoules prêtes à l’emploi

17 Etape 3a : Inoculation Banque cellulaire Fermenteur Flacon agitateur
22 15 Etape 3a : Inoculation Banque cellulaire Fermenteur Flacon agitateur Flacon en T Flacons cylindriques d’inoculat

18 Etape 3b : Culture cellulaire
23 15A Etape 3b : Culture cellulaire Flacon cylindrique Phase de croissance Cycle 1 de production Cycle 2 de production Concentration/diafiltration Protéine brute en vrac Changement de milieu Changement de milieu Récolte 2 Récolte 1

19 Etape 3c : Purification Protéine brute décongelée Chromatographie
24 15B Etape 3c : Purification Protéine brute décongelée Chromatographie sur colonne Filtration stérile Protéine purifiée en vrac

20 Ampoules prêtes à l’emploi
25 15C Etape 3d : Formulation Protéine purifiée en vrac Tampon et stabilisateurs Ampoules prêtes à l’emploi

21 Etape 4: Contrôle qualité
27 Etape 4: Contrôle qualité Plasmides et cellules-hôtes Produit en vrac Validation du processus Lots de produit final 8+ tests Par exemple : Caryotype, criblage d’infectiosité/ oncogénicité, stabilité du gène 20+ tests Par exemple : Séquence Amino-acide, cartes de peptide, CLHP, SDS-PAGE, dosage radio- immunologique, dosages biologiques 10+ tests Par exemple : Recherche d’endotoxine, provocation par protéine, rendement en protéine 30+ tests Par exemple : Analyse réitérée de la protéine, pureté, contamination de l’ADN, tests de stabilité : – congélation – chauffage – dénaturation – pH

22 Technologie des anticorps monoclonaux
30 4. Sélection des hybridomes capables de produire des anticorps monoclonaux 1. Souris immunisée contre l’antigène d’intérêt 2. Cellules B productrices d’anticorps extraites de la rate 5. Culture du meilleur hybridome 3. Cellules B fusionnées avec les cellules myélomateuses (hybridome) Cellules myléomateuses 6. Récolte et purification des anticorps monoclonaux

23 Thérapie Génique Objectifs Lymphocytes Fibroblastes
36 19C Objectifs Lymphocytes Fibroblastes Cellules endothéliales Kératinocytes Hépatocytes Myocytes Epithélium bronchique Cellules-souches médullaires Cellules cibles Corriger un déficit héréditaire Corriger un déficit génique acquis Programmer une cellule pour exprimer de nouvelles propriétés

24 Cibles de la thérapie génique
37 19D 1 Maladie de Gaucher, obésité, neuropathie de Charcot-Marie-Tooth Dystrophie musculaire, adrénoleucodystrophie, hémophilie, syndrome de Barth 2 Cancer familial du côlon, stérilité X 3 Rétinite pigmentaire, syndrome de von Hippel-Lindau Neurofibromatose de type 2 22 Y 4 Maladie de Huntington Syndrome de Down, sclérose latérale amyotrophique, maladie d’Alzheimer 21 5 Polypose colique familiale Déficit en ADA, syndrome d’Alagille 20 19 6 Hypercholestérolémie familiale, dystrophie myotonique, BCL3 Hémochromatose, ataxie spino-cérébelleuse, bec de lièvre et fente palatine Amyloïdose, groupe sanguin kidd 18 7 Mucoviscidose, syndrome de Williams Polykystose rénale, BRCA1 17 8 Exostoses multiples, syndrome de Werner, Syndrome de Langer-Gideon Polykystose rénale, fièvre méditerranéenne familiale 16 9 Mélanome malin, ataxie de Friedriech Maladie de Tay-Sachs, xeroderma pigmentosum 15 10 Néoplasie endocrinienne multiple de type 2 Maladie d’Alzheimer, porphyria variegata 14 11 13 12 Anémie falciforme, syndrome du QT long Rétinoblastome, BRCA2, syndrome de Wilson Phénylcétonurie, diabète de type 2, syndrome de Stickler

25 Projet du génome humain
Objectifs Créer une carte génétique 1 Marqueurs Créer une carte physique 2 Clones Séquencer toutes les paires de base 3 ...ACGTAATTCATGCCCCGG... Créer des informations, des outils, des forums et des formations 4

26 Blocage des nucléotides : Thérapie anti-sens
44 Pro/Health 18 Mécanisme en présence de virus ou d’oncogènes : Anti-sens biologique (anti-ARNm) La liaison complémentaire bloque la traduction de l’ARNm protéines responsables de pathologies non synthétisées Vecteur (virus ou lipide) ARNm cible (filament sens) Cibles potentielles : Virus Cancers Maladies auto-immunes

27 Créer des animaux transgéniques comme modèles de maladies
45 Pro/Health 21A 1. Récolte d’ovocytes fertilisés de souris 2. Gènes du cancer du sein isolés, copiés, injectés dans les ovocytes Souris transgénique 4. Environ un tiers de la portée est transgénique, avec présence des gènes du cancer dans toutes les cellules 3. Ovocytes contenant les gènes du cancer transplantés chez la mère Source: Biotechnology for the 21st Century, 1995.

28 Apoptose Rôles physiologiques Rôles pathologiques 48 21C
Activation inappropriée Inhibition inappropriée Développement Homéostase bone marrow Moelle osseuse mutation ßêta-amyloïde sensibilité aux toxines expression des gènes anti-apoptose dans le membre foetal dans la division rapide des leucocytes dans la maladie d’Alzheimer dans l’infection virale * Bone marrow : Moelle osseuse

29 Sénescence cellulaire, télomères et vieillissement
49 21D Cellules somatiques normales  Senescence  Sénescence Télomères   Maladie du viellissement  Immortalité cellulaire Cellules cancéreuses  Télomérase   Ajoute des télomères Adapted from Science, 1994.

30 Cellule souche lymphoïde
Facteurs de croissance hématopoïétiques 5 Cellule souche pluripotente Blaste CFU Ligand flk-2/flt-3 SCF Ligand flk-2/flt-3 SCF Ligand flk-2/flt-3 SCF Ligand flk-2/flt-3 SCF CFU-GEMM Cellule souche lymphoïde Précurseur NK SCF IL-3 MGDF/TPO SCF IL-3 SCF IL-3 Ligand flk-2/flt-3 SCF IL-3 SCF IL-3 SCF IL-3 SCF Ligand flk-2/flt-3 IL-7 SCF Ligand flk-2/flt-3 IL-7 BFU-E CFU-Meg CFU-GM CFU-Eo CFU-Ba CFU-Mastocyte Cellule pré-B Cellule pré-T SCF IL-3 GM-CSF EPO SCF IL-3 GM-CSF IL-11 IL-6 MGDF/TPO IL-3 GM-CSF G-CSF IL-3 GM-CSF IL-7 CFU-E CFU-G CFU-M IL-3 GM-CSF EPO IL-3 GM-CSF G-CSF IL-3 GM-CSF M-CSF IL-3 GM-CSF IL-3 IL-3 SCF IL-6 IL-2 IL-7 SCF IL-2 Mégacaryocyte Proplaquettes Monocyte Lymphocyte B GM-CSF M-CSF Réticulocyte Neutrophile Eosinophile Mastocyte tissulaire Lymphocyte T Hématie Plaquettes Macrophage Basophile Plasmocyte Cellule NK

31 Facteurs Neurotrophiques
23 Relations avec les troubles neurologiques Comment les neurotrophines pourraient agir dans les maladies du neurone moteur Neuropathie périphérique Neurones sensoriels Neurones sympathiques Neurones parasympathiques Sclérose latérale amyotrophique (SLA) Neurones moteurs Maladie d'Alzheimer Neurones cholinergiques du cerveau antérieur Neurones néocorticaux Maladie de Parkinson Neurones dopaminergiques NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5 NGF, FGF-2 CNTF CNTF, BDNF, NT-4/5, IGF-1, GDNF Induisent le bourgeonnement des plaques terminales motrices 3 NGF BDNF, NT-3, NT-4/5 Favorisent la régénération axonale GDNF, BDNF, NT-4/5, FGF-1, FGF-2, IGF-1 2 BDNF NT-3 Récepteurs spécifiques 4 Augmentent la masse et la force musculaires TrkB TrkC Actions spécifiques Favorisent la survie des neurones moteurs 1 Membrane cellulaire Barrière hémato-méningée

32 d’un vaccin recombinant Antigène viral non-infectieux
Vaccin recombinants 28 Comment sont-ils fabriqués ? Développement d’un vaccin classique Développement d’un vaccin recombinant En cours de développement Maladies infectieuses VIH, HSV, CMV, hépatite B, grippe, rotavirus, coqueluche, maladie de Lyme, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatis Cancer Mélanome, sein, côlon, ovaire, col utérin, prostate Sclérose en plaques Polyarthrite rhumatoïde Psoriasis Contraception Vaccins à base d’ADN recombinant Clonage du gène de l’antigène viral dans une cellule de levure Vecteurs viraux Pool de plasma humain Purification Antigène viral non-infectieux Inactivation Purification

33 Problèmes pratiques concernant la manipulation des matériaux biologiques
2 Conservation réfrigération habituellement nécessaire la congélation/décongélation et la chaleur peuvent dénaturer la protéine Stérilité absence habituelle d’agent de conservation Préparation une agitation excessive pendant la reconstitution peut dénaturer la protéine l’utilisation d’un diluant approprié est essentielle peuvent adhérer au plastique ou au verre calculs des doses basés sur les unités d’activité vs les unités pondérales (micro grammes) administration habituellement parentérale (SC ou IV) Problèmes concernant l’administration à domicile Transport Auto-administration Formation du patient


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