Utilisation d’une peau totale reconstruite in vitro dans le traitement des plaies chroniques Pr Vincent CASOLI Service de Chirurgie Plastique Reconstructrice.

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1 Utilisation d’une peau totale reconstruite in vitro dans le traitement des plaies chroniques Pr Vincent CASOLI Service de Chirurgie Plastique Reconstructrice et Esthétique –Brûlés – Chirurgie de la Main Muriel CARIO-ANDRE Unité Inserm U1035 Biothérapie des Maladies Génétiques Inflammatoires et Cancers CHU Bordeaux

2 Options thérapeutiques ulcères de jambe - pied diabétique Traitement médical Soins locaux Traitement chirurgical (stripping, chir endo, laser,...) Greffes (mince, filet, pastilles) Pansements Selon atteinte vaisseaux (superf, profonde,..) Substituts de peau et/ou

3 Classification des substituts de peau Bioengineered skin substitutes ►Culture d’épidermes EpiCel™(autogreffe) Epifix ® (allogreffe) ►Substituts allogéniques humains dérivés de peau de cadavre humain AlloDerm ®, Alloskin™, TheraSkin ®... ►Matrices allogéniques dérivées de fibroblastes humains néonataux AlloMax™, Celaderm ®, Dermagraft ® ►Matrices composites dérivées de kératinocytes et fibroblastes humains et de collagène bovin ou porcin Apligraf ®, OrCel™, TransCyte™ ►Matrices acellulaires dérivées de collagène bovin ou porcin Integra ®, Biobrane ®, Nevelia ®, Matriderm ®

4 Source: Regenerative Medicine Annual Industry Report - 2014

5 Notre technologie: peau totale autologue pigmentée Naevus géant congénital Brûlures Plaies chroniques (ulcères, pied diabétique) Indications

6 Kératinocytes : 90% Mélanocytes : 5% Cellules de Langerhans :2-8% Cellules de Merkel: 1% Couche Basale : 5 - 10 kératinocytes /1 mélanocyte Unité épidermique de mélanisation: 1 mélanocyte pour 36 kératinocytes Epiderme Derme mélanocyte fibroblaste Jonction dermo-épidermique Structure de la peau

7 derme épiderme Dégraissage et découpage en morceaux 0, 5 cm² Collagénase Principe de reconstruction: mise en culture de fibroblastes Ensemencement des fibroblastes dans milieu spécifique Amplification 1 semaine

8 derme épiderme Dégraisssage et découpage en morceaux 0, 5 cm² Trypsinisation Retrait couche supérieure de l’épiderme Grattage, filtration, centrifugation Mise en culture kératinocytes et mélanocytes trypsine Ensemencement dans milieux spécifiques kératinocytes mélanocytes

9 Primoculture kératinocytes et mélanocytes Kératinocytes Mélanocytes Amplification kératinocytes et mélanocytes Purification par trypsinisation différentielle et Amplification (2 semaines)

10 Méthode de reconstruction Phase de prolifération (7 jours) Phase de différenciation (7 jours) matrice collagénique Peau reconstruite totale autologue pigmentée Phase d’adhésion (24h) Phase de production collagène (7 jours) Phase d’adhésion (24h) fibroblastes ker + mel

11 Melan-A (mélanocytes) Laminine 5 γ2 (connexion cellules ép./mb basale) Collagène VII (ancrage lame basale/derme) Collagène IV (mb basale) Collagène IV (matrice superficielle-profonde) Hématoxyline-éosine Analyse immunohistochimique de la peau totale EP D

12 Analyse immunohistochimique de la peau totale Collagène IV/p63Fontana Masson Protéine p63 (rouge) Marquage cellules souches épithéliales Collagène IV (vert fluo) Collagène I (vert) Noyaux cellules (bleu) Mél suprabasaux (rouge fluo) Collagène I (rouge) Noyaux (bleu)

13 En quoi est-ce une innovation technologique ? Pas de produit similaire actuellement disponible sur le marché Par rapport à une greffePar rapport à un substitut dermique -Nouvelle peau avec cellules renouvelées: plus solide, meilleure cicatrisation -Pas d’anesthésie générale -Moins de séquelles site donneur (petite biopsie inguinale ou cuir chevelu) -Traitement plaies de grande taille (amplification) -Peau totale : apport des 3 types cellulaires hiérarchisés sur le site receveur -Peau autologue -Une seule application -Peau pigmentée

14 Cultures cellulaires Mise au point milieu de grade clinique Reproductibilité conditions de culture Etat d’avancement phase pré-clinique Reproductibilité des reconstructions Greffes des lots reconstruits sur souris Reconstructions en conditions GMP Dossier AEC