POPULATION D ’ADN COMPLEXE - ADN génomique ou - copie d ’ARNm = C DNA Amplification spécifique Clonage dans des vecteurs Amplification in vitro PCR Détection.

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1 POPULATION D ’ADN COMPLEXE - ADN génomique ou - copie d ’ARNm = C DNA Amplification spécifique Clonage dans des vecteurs Amplification in vitro PCR Détection spécifique Hybridation moléculaire - vecteur - lier le fragment d ’ADN au vecteur - transfert dans l’hôte - polymérase thermostable -information sur la séquence permettant de générer des amorces d’amplification - Sonde ADN ou ARN marquée

2 LE CLONAGE

3 I - Propriétés des vecteurs de clonage capables de réplication autonome dans une cellule hôte donnée (origine de réplication de type procaryotique et/ ou eucaryotique) possèdent un polylinker ou site multiple de clonage Possèdent des propriétés permettant la sélection de la cellule hôte (résistance ATB) supportent l’insertion d’un fragment d’ADN plus ou moins grand Molecular Cell Biology

4 II – Principes généraux d’utilisation d’un vecteur - Préparation du vecteur - Préparation de l’ADN à insérer - Réalisation d’un recombinant - Incorporation à l’hôte

5 Obtention de l’ADN recombinant An Introduction to Genetic Analysis + traitement PAL

6 La ligation (ligature...) Une enzyme, la ligase, est capable de lier de façon covalente deux molécules d’ADN en une. Molecular Cell Biology

7 Différents vecteurs de clonage Taille maximum approximative du fragment d’ADN qui peut être cloné dans chaque vecteur

8 Les plasmides comme vecteurs de clonage (1) Molécule d’ADN de taille réduite, d'origine bactérienne Molécule d’ADN circulaire – taille 2kb à 5kb Peut accepter jusqu’à 10kb d’ADN exogène Peut être considérée comme un minichromosome capable de réplication autonome Confère la résistance à un ou plusieurs antibiotiques= sélection Molecular Cell Biology

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11 Les plasmides comme vecteur de clonage (2)

12 Définition Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la succession des nucléotides le composant. C’est aujourd'hui une technique de routine pour les laboratoires de biologie. Cette technique utilise les connaissances qui ont été acquises depuis une trentaine d'années sur les mécanismes de la réplication de l'ADN. II – Principes généraux d’utilisation d’un vecteur - Préparation du vecteur - Préparation de l’ADN à insérer - Réalisation d’un recombinant - Incorporation à l’hôte

13 De type procaryotique (bactéries): Cas d’un vecteur plasmidique: l’ADN est introduit dans les bactéries traitées spécialement le plus souvent par choc thermique ou par choc électrique. Introduction de l’ADN recombinant dans les cellules hôtes électroporateur

14 Identification des clones intéressants Molecular Cell Biology Dans ce cas les bactéries transformées avec le vecteur ne possédant pas ou possédant l’insert sont sélectionnées --> un criblage est nécessaire

15 Amp R Tet R Amp R Tet S Clone intéressant Criblage des clones intéressants (3) pBR322

16 Définition Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la succession des nucléotides le composant. C’est aujourd'hui une technique de routine pour les laboratoires de biologie. Cette technique utilise les connaissances qui ont été acquises depuis une trentaine d'années sur les mécanismes de la réplication de l'ADN.

17 Criblage -screening- des clones intéressants (2) An Introduction to Genetic Analysis Test blanc-bleu (  complémentation)

18 III - Différents vecteurs de clonage Taille maximum approximative du fragment d’ADN qui peut être cloné dans chaque vecteur

19 Les phages comme vecteurs de clonage Molecular Cell Biology  Phage = virus de bactéries

20 Définition Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la succession des nucléotides le composant. C’est aujourd'hui une technique de routine pour les laboratoires de biologie. Cette technique utilise les connaissances qui ont été acquises depuis une trentaine d'années sur les mécanismes de la réplication de l'ADN.

21 Introduction de l’ADN recombinant dans les cellules hôtes De type procaryotique: Cas d’un vecteur phagique

22 Les cosmides comme vecteurs de clonage Molecular Cell Biology

23 Les YACs comme vecteurs de clonage YAC : Yeast Artificial chromosome

24 Criblage d’une banque phagique An Introduction to Genetic Analysis Hybridation avec uns sonde spécifique... Prochain cours!

25 IV - APPLICATIONS DES VECTEURS - Clonage et amplification d’une séquence d’ADN - Création des banques d’ADN génomiques et d’ADNc - Introduction d’un gène dans des cellules, des plantes ou des organismes(animaux transgéniques) - Production d’ARN - Production de protéines codées par les gènes insérés

26 Banques d’ADN -Banques d’ADN génomique - Banques de cDNA

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28 Banque (librairie) d’ADN génomique Molecular Cell Biology

29 Comment définir si une banque est suffisamment grande pour espérer trouver un fragment d’intérêt? Calcul afin de définir la probabilité de trouver une séquence donnée dans une banque. N=ln(1-P)/ln(1-f) N: nombre de recombinants P: probabilité désirée f: proportion de génome dans un seul recombinant Ex: 99% de probabilité d’avoir une séquence représentée dans une banque de fragments de 17kb d’un génome eucaryote (3.10 9 pb) N= ln(1-0.99)/ln(1-(1,7.10 4 / 3.10 9 ))=8,1.10 5 colonies

30 Banque d’ADNc Le problème ici est l’obtention de clone dit « full length ».

31 Obtention de l’ADN de l’organisme donneur A partir de l’ARN: Principe de la "reverse transcription": An Introduction to Genetic Analysis

32 Définition Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la succession des nucléotides le composant. C’est aujourd'hui une technique de routine pour les laboratoires de biologie. Cette technique utilise les connaissances qui ont été acquises depuis une trentaine d'années sur les mécanismes de la réplication de l'ADN. APPLICATIONS DES VECTEURS - Clonage et amplification d’une séquence d’ADN - Création des banques d’ADN génomiques et d’ADNc - Production de protéines codées par les gènes insérés -Introduction d’un gène dans des cellules, des plantes ou des organismes(animaux transgéniques)

33 Production de protéines Utilisation de vecteur d’expression Molecular Cell Biology

34 Production de protéines humaines à but thérapeutique - Facteur VIII de la coagulation dans l’hémophilie A - Hormone de croissance - Insuline

35 Exemple de l’insuline

36 Définition Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la succession des nucléotides le composant. C’est aujourd'hui une technique de routine pour les laboratoires de biologie. Cette technique utilise les connaissances qui ont été acquises depuis une trentaine d'années sur les mécanismes de la réplication de l'ADN. CELLULES HÔTES -Bactéries : E. Coli premier hôte utilisé nombreux vecteurs plasmidiques connus et utilisables culture en masse dans les fermenteurs taux d’expression élevés (plusieurs g de protéine/litre) MAIS secrètent mal les protéines : éclatement des bactéries pas de modifications post-traductionnelles -Levure saccharomyces cerevisiae modifications post traductionnelles MAIS pas de secrétion, moins bon rendement -Cellules CHO (chinese hamster ovary) culture de masse en bioréacteurs, protéines complexes MAIS cher et rendement plus faible

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38 Levures et bactéries utilisées comme usines: production d'antibiotiques -pénicilline, tétracycline-, d'enzymes comme lipases -lessives-... Vaccins : fraction de protéines virales nécessaire à la production d’AC Bioréactifs – Enzymes de restriction diminution du coût Autres exemples

39 Création de plantes transgéniques An Introduction to Genetic Analysis

40 Création d’animaux transgéniques