Emilien DROUOT, AMMIQ 2012, Rimouski

Présentation au sujet: "Emilien DROUOT, AMMIQ 2012, Rimouski"— Transcription de la présentation:

1 Emilien DROUOT, AMMIQ 2012, Rimouski
Nouvelle méthode de génération de virus recombinants pour la caractérisation de la résistance du cytomégalovirus aux antiviraux Emilien DROUOT, AMMIQ 2012, Rimouski

2 Manifestations cliniques
Séroprévalence A travers le monde, entre 45 et 100% de la population Infections chez les patients immunocompétents Asymptomatiques (90% des infections primaires) Mononucléose Transmission mère-enfant (20 à 40% lors d’une infection primaire) Infections chez les patients immunosupprimés Patients transplantés (organes solides, moelle) Patients sidéens (moins à risque avec la trithérapie) Plus sévères (hépatite, pneumonie, entérite, encéphalite, rétinite) Cannon et al, Rev. Med. Virol., 2010; Fields’ Virology, 2007, Vol. 2, p. 2702

3 Mécanisme d’action des antiviraux
Cellule infectée par le HCMV Kinases Cellulaires pUL97 Kinase virale GCV GCV-MP GCV-TP Liaison dNTP HCMV ADN pol FOS Liaison PPi CDV CDV-DP dNTP Traitement de première ligne  analogue de nucléosides : GCV, VGCV Traitement de deuxième ligne  analogue de nucléotides : CDV analogue de pyrophosphate : FOS Une seule cible finale : l’adn pol D’après Gilbert et Boivin, AAC, 2005;

4 Mutations conférant la résistance aux antiviraux
Dans les deux gènes impliqués dans le mécanisme d’action des antiviraux UL97 (Phosphotransférase virale) UL54 (ADN Polymérase) D’après Lurain et al, Clin Microbiol Rev, 2010;

5 Sensibilité du HCMV aux antiviraux: méthode de référence
Test de réduction des plaques (Plaque Reduction Assay, PRA) Cellules fibroblastiques Inoculum constant de virus (~ 50 UFP) Concentrations croissantes d’antiviral en milieu semi-solide (agarose) Fixation et coloration Décompte des effets cytopathiques [Antiviral] inhibant 50% des effets cytopathiques (CE50) Inconvénients: temps d’incubation (7 jrs), décompte subjectif et fastidieux D’après Landry et al, AAC, 2000;

6 Problématique du projet de recherche
Incidence de la résistance chez les patients immunosupprimés: Rare chez les patients infectés par le HCMV naïfs pour le traitement avec le GCV Chez 10% des patients transplantés infectés par HCMV traités avec le GCV Chez 5 à 10% des patients sidéens infectés par HCMV traités avec le GCV Polymorphisme associé aux gènes UL97 et UL54  Importance de caractériser le rôle des mutations dans la résistance au niveau moléculaire et phénotypique Gilbert et Boivin, AAC, 2005; Fields’ Virology, 2007, Vol. 2, p. 2702 Chou, Rev. Med. Virol. 2008; 18: 233–246

7 Objectifs du projet de recherche
Développer un système de génération de virus recombinants permettant de déterminer le rôle des mutations dans la résistance aux antiviraux Disposer d’un système de génération rapide, efficace et ne laissant aucune séquence cicatrice Utiliser un gène rapporteur permettant de déterminer des CE50 de manière rapide et objective (vs PRA) Compléter la banque de données des mutations reliant le génotype au phénotype de résistance

8 Génération de virus recombinants
Système de génération basé sur l’utilisation des protéines de recombinaison du phage λ: Clonage du génome de la souche AD169 dans un chromosome bactérien artificiel (BAC)  pHB5 Manipulation du génome pHB5 en bactéries modifiées génétiquement pour exprimer les protéines de recombinaison Introduction d’une mutation n’importe où dans le génome sans aucune séquence cicatrice D’après Tischer et al, Methods Mol Biol. 2010;634:421-30

9 Génération de virus recombinants
Introduction d’un gène rapporteur dans le génome viral: Gène codant pour la Gaussia luciferase Petite taille: 153 a.a. Naturellement sécrétée: dosage à partir du milieu de culture des cellules infectées Luminescence supérieure à celles produites par les autres luciférases (Renilla, Firefly)  Rapidité et objectivité des résultats vs PRA

10 Résultats Capacités réplicatives du virus recombinant sauvage vs AD169

11 Résultats Sensibilité du virus recombinant sauvage vs AD169 aux antiviraux par PRA Souche virale Ganciclovir (CE50 µM) Foscarnet (CE50 µM) AD169 4,52 ± 0,62 63,10 ± 10,13 pHB5-Gluc 4,59 ± 1,23 55,65 ± 7,99

12 Résultats Expression de la Gluc en fonction de la MOI au cours du temps

13 CE50 µM (ratio sauvage) par dosage Gluc
Résultats Sensibilités des différents virus recombinants générés aux antiviraux par mesures de Gluc CE50 µM (ratio sauvage) par dosage Gluc Mutation Gène Ganciclovir Foscarnet cidofovir Sauvage --- 1,8 ± 0,5 (1) 41 ± 7,3 (1) 0,4 ± 0,1 (1) A594V UL97 16,7 ± 4,8 (9,3)  --- ---  E756K UL54 4,6 ± 0,5 (2,6) 144,4 ± 30,2 (4,3) 0,76 ± 0,11 (1,9) V526L 6,1 ± 2,6 (3,4) 43,6 ± 7,4 (1) 0,11 ± 0,09 (0,3)

14 Conclusions Génération de virus recombinants:
Augmentation de la performance du système: Rapidité et efficacité Absence de séquence cicatrice Utilisation d’un gène rapporteur (G. luciférase): Objectivité des résultats Rapidité

15 Perspectives Etude des effets combinatoires de plusieurs mutations:
Possibilité de générer différentes mutations dans un ou plusieurs gènes au sein d’un même virus recombinant Etudier l’effet combinatoire de plusieurs mutations sur le phénotype de résistance et/ou les capacités réplicatives

16 Questions

17 * * + * PCR / Electroporation * * Red-Recombinaison pHB5
Kanr I-SceI * PCR / Electroporation I-SceI Kanr * * + Red-Recombinaison pHB5 UL US * Expression de I-SceI Clivage I-SceI Kanr Séquence mutante pHB5 UL US * pHB5 Red-Recombinaison