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Protocole conjugaison triparentale pour une transposition
- Cellule donneuse : E. coli HB101 pJBA28 - Cellule helper : E. coli HB101 RK600 - Cellule receveuse : Pseudomonas putida KT2440 Jour 1 - Faire une préculture dans 5 mL de LB une nuit avec agitation. Jour 2 Lavage des cellules - Centrifuger 500 l de chaque culture dans des Eppendorf de 1,5 ml (6500 rpm, 6 min, 4°C). - Eliminer le surnageant et rincer le culot cellulaire avec 500 ml de NaCl 0,9%. - Centrifuger à nouveau la suspension cellulaire (6500 rpm, 6 min, 4°C). - Eliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire avec 500 ml de NaCl 0,9%. Mélange conjugatif - Mélanger dans un Ependorf de 1,5 ml. 10 ml de cellule donneuse : E. coli HB101 pJBA28 10 ml de cellule helper : E. coli HB101 RK600 - 30 ml de cellule receveuse : Pseudomonas putida KT2440 - Déposer sur une boite de LB la goutte de 50 ml de conjugaison ainsi que les différents témoins négatifs et incuber 24H à 28°C. Témoin négatif 10 l cellule réceptrice Témoin négatif 10 l cellule donneuse Témoin négatif 10 l cellule helper Conjugaison triparentale 50 l de mélange
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