Epidermolyses bulleuses: physiopathologie génotype/phénotype

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1 Epidermolyses bulleuses: physiopathologie génotype/phénotype
Diagnostic anténatal Structure/fonction réversion phénotypique thérapie génique ABERDAM Daniel INSERM U634

2 BP280 Collagène VII Cytokératines Plectine kératinocyte

3 BP280 Collagène VII Cytokératines Plectine kératinocyte Hémidesmosomes

4 Anticorps monoclonal GB3
Immunisation de souris par des antigènes Collecte du sérum (lymphocytes B) Fusion des lymphocytes B avec une lignée lymphoma: hybridome Sélection clonale d’un hybridome

5 EPIDERMOLYSIS BULLOSA
(EB) Epidermolyse Bulleuse Simplex Epidermolyse Bulleuse Jonctionnelle Epidermolyse Bulleuse Dystrophique Cytokeratines Peau EB EBS (R) Plectine BP280 Epiderme EBJ (R) Derme EBD (D et R) Collagène VII

6 Anticorps monoclonal GB3

7 Anticorps monoclonal GB3
Cytokeratines K5/K14 EBS Plectine BP280 Intégrine 64 EBJ EBD Collagène VII

8 Epidermolyse bulleuse jonctionnelle(EBJ)
* * * contrôle EBJ

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10 Cellules du patient ADN génomique ARNm Protéines Southern blot PCR
Banque génomique ChIP Northern blot RT-PCR Banque d’ADNc Banque d’expression Western blot IP Anticorps

11 Molécule trimérique, sécrétée dans la MEC
Protéine sécrétée IF IP

12 Criblage de banque d’expression
Colonne d’affinité GB3 Anticorps polyclonaux Criblage de banque d’expression Clonage et séquençage Sequençage de peptides Oligonucléotides dégénérés RT-PCR et clonage

13 kératinocyte Laminine-5    1q25-q31 18p11.3 1q32 Cytokératines
NH2 Laminine-5 2 -    1q25-q31 18p11.3 1q32 Cytokératines Plectine BP280 Intégrine 64 Collagène XVII (BP180) Laminine-5 Collagène VII

14 Immunofluorescence sur biopsies cutanées
3 3 2 Contrôle Patient

15 Liaison génétique entre le gène LAMC2 et l’EBJ-H
Difficultés: trois gènes. caractère récessif et léthal 3 familles consanguines Recherche de microsatellites CA/GT proches (ou dans le locus LAMC2) 3 marqueurs AFM + un microsatellite lié à LAMC2 (variabilité de 13 allèles # dans la population caucasienne) CACA….CACA

16 gène ADNc 5’ 3’ C P Hétéroduplex Homoduplex

17 Famille consanguine. Patient homozygote
contrôle Mutant T C G A T C G A 3 ’ A A Stop Arg G G C T 5 ’ 3 3 2 Northern blot N M N M N M Exon 3

18 Allele-Specific Oligonucleotide (ASO)
Example d’une famille non consanguine Mutation portée par la mère Mutation portée par le père

19 Formes non léthales d’EBJ
Expression réduite de laminine-5 mutée Etat traumatique, sans soins efficaces

20 culture in vitro de kératinocytes
THERAPIE GENIQUE CUTANEE Ex vivo Diagnostic génotypage biopsie cutanée culture in vitro de kératinocytes transduction rétrovirale greffe feuillets épithéliaux

21 Thérapie génique des EB
Phénotype/génotype: - diagnostic (immunohistologie, moléculaire) - recherche de mutation Transfert de gène: - primo culture - choix du vecteur (lentivirus, intégrases,…) - réversion phénotypique Transplantation: - modèles animaux - prise de greffe - évaluation de la réponse immunitaire - expression du transgène in vivo sur du long terme - évaluation des risques de mutation insertionnelle du transgène

22 PRODUCTION D ’UN VIRUS « CURATIF »
Laminine 5 Vecteur viral Production de particules virales Culture in vitro de kératinocytes EB

23 R é version ph é notypique de k é ratinocytes EBJ EBJ EBJ - R WT EBJ
Cha î ne ß 3 - mutations R42X / E210K EBJ EBJ - R WT EBJ EBJ -R

24 MC DC EBJ reverted Vinculine detached cells (%) minutes
10 20 30 MC reverted 100 80 60 40 DC EBJ EBJ detached cells (%) 20 40 60 80 100 5 10 15 minutes wt reverté K EBJ Vinculine EBJ-R

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29 Applications potentielles de la thérapie génique cutanée
correction de défauts géniques catabolisme de toxines circulantes sécretion de médicaments diffusibles

30 Promoteur K5-leptin-LacZ
Correction du phénotype d’obésité par transplantation d’une peau transgénique Larcher et al.(2001) . FASEB J 15: Day 9 Day 32 Promoteur K5-leptin-LacZ 1 Souris ob/ob 2 Greffe d’épiderme human exprimant la leptine 0,5 1 1,5 2,5 5 10 15 days serum leptin (ng/ml) Leptin HK control