Etude du stress oxydant

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1 Etude du stress oxydant

2 4 – 4 % d’oxygène ne sera pas transformé en H2O
0.4 – 4 % d’oxygène ne sera pas transformé en H2O. L’O2 donnera naissance à des entités oxygénées activées (EOA) parmi lesquelles figurent les radicaux libres comme l’anion superoxyde. D’autres entités non radicalaires de l’O2 peuvent être produites comme le peroxyde d’oxygène (H2O2) ou l’oxygène singulet

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20 Stress oxydant au niveau des LIPIDES
La peroxydation lipidique a lieu principalement dans les acides gras polyinsaturés des membranes cellulaires ou dans les acides gras polyinsaturés des lipoprotéines (LDL). Elle fournit également une grande variété de produits qui peuvent réagir avec les protéines et l'ADN (Marnett, 1999). Parmi les produits formés lors de la peroxydation lipidique, l'isoprostane, le malondialdéhyde (MDA), le acides thiobarbiturique (TBARS) et le 4-hydroxynonenal (4- HNE) sont étudiés comme marqueurs de la peroxydation lipidique.

21 Stress oxydant au niveau des Protéines
les protéines sont aussi susceptibles d'être oxydées par les ROS. Cette oxydation provoque l'introduction d'un groupe carbonyl dans la protéine. Ces changements conduisent à une modification structurale des protéines dont les conséquences sont majeures (perte de fonction catalytique, augmentation de la sensibilité aux protéases…) Dommage de l’ADN L’oxydation de l’ADN aboutit à la formation de fragments 8-OH-2’-deoxyguanosine (8-OH2DG). Ces derniers sont éliminés par les enzymes de réparation de L’ADN mais si ces systèmes sont défaillants ou dépassés, la 8 OH-2’-deoxyguanosine s’accumulera au sein de l’ADN pouvant causer des mutations.

22 Les marqueurs biologiques de stress oxydant

23 Le dosage du MDA réalisé par une méthode spectrophotométriques : la méthode d’Ohkawa [Ohkawa et al., 1979], cette méthode utilise l’acide thiobarbiturique (TBA). En effet, une molécule de MDA en milieu acide et à chaud est condensée avec deux molécules de TBA pour formé un complexe coloré en rose (cf. figure 14) susceptible d’un dosage spectrophotométrique à une longueur d’onde λ = 532 nm

24 OXYDATION DES PROTEINES (MESURE DES THIOLS)
Les Thiols sont dosées selon la méthode de Faure & Lafond (1995). Le principe du dosage de l'oxydation des protéines est basé sur la mesure des groupements SH réagissants avec le 5-5'-DiThiobis(2-acide NitroBenzoïque) (DTNB) pour former un composé coloré (λ = 415 nm). GLUTATHION Le principe du dosage du glutathion est basé sur la réduction du 5-5'-DiThiobis(2-acide NitroBenzoïque) (DTNB) par le NADPH. La formation de 5-Thio-2-NitroBenzoate (TNB) est suivie par spectrophotométrie à 412 nm. La sensibilité du dosage peut être augmentée en mesurant la disparition du NADPH par fluorimétrie.

25 SUPEROXYDE DISMUTASE (SOD)
Le dosage de la SOD est effectué selon la méthode de Marklund & Marklund (1974). L’autooxydation du pyrogallol en présence d’EDTA est inhibée par la SOD. De pH 7.9 à 9.1, la réaction est inhibée jusqu'à 90% par la SOD Glutathion peroxidase GPx Le principe de dosage de la GPx est basé sur une réaction couplée entre la GPx et la glutathion réductase (GR). La détermination de l'activité de la GPx repose ainsi sur la mesure de la disparition du NADPH,H+ suivie par spectrophotométrie à 340 nm, avec comme substrat réactionnel le t-butyl hydroperoxyde.

26 CATALASE La quantité d'H2O2 décomposé est directement proportionnelle à la concentration en substrat et la concentration en enzyme. Exploration de l’α-tocophérol et des oligo-éléments L’α-tocophérol (vit E) plasmatique peut être mesuré par chromatographie liquide haute performance (HPLC).

27 Mesure de L’ADN COMET” qui permet de mesurer les cassures dans l’ADN de simples cellules comme les lymphocytes. Après avoir été déposées sur un gel d’agarose, les cellules sont lysées avec un détergent puis traitées avec une solution à haute concentration en sels. Ces opérations permettent de former des nucléotides, ce qui a pour conséquence que l’ADN contenant des cassures et soumis à une électrophorèse migrera vers une anode sous la forme d’une queue de comète. Après coloration, les gels sont examinés en microscopie fluorescente. L’intensité relative de la fluorescence mesurée dans la queue de la comète est directement proportionnelle à la fréquence de cassures dans l’ADN.

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29 Dosage de MDA

30 - L'activité de la glutathion peroxydase
Mesure de l’activité de la SOD - L'activité de la glutathion peroxydase Mesure de LDL oxydé (l’aide de techniques ELISA)

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