Avant-propos sur les « CD »

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2 Avant-propos sur les « CD »
On désigne souvent les protéines cellulaires (notamment membranaires) sous le terme de CDn (CD1, CD2, CD3, CD4, etc.) Pourquoi?

3 Les anticorps monoclonaux
Injection des antigènes (ou des mélanges d’antigènes) contre lesquels on veut générer des anticorps

4 Les anticorps monoclonaux
Prélèvement du sang de la souris et fusion des lymphocytes B avec des cellules immortalisées : obtention d’hybridomes

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6 Les anticorps monoclonaux
Screening des différents clones obtenus avec les cellules utilisées pour l’immunisation

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8 Qu’est ce qu’un CD? CD : cluster of designation
nom initialement donné à l’ensemble des anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes ou les antigènes d’une même protéine présente à la surface cellulaire par extension, le CDn désigne la protéine elle-même; les anticorps étant dénommés anti-CDn

9 Utilisation des anticorps monoclonaux pour caratériser les sous-populations de leukocytes
Inoculation de leukocytes humains à des souris Génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre les protéines de membrane Utilisation conjointe du westernblot et du Facs pour définir La nature de la protéine reconnue Les sous-populations sur laquelle elle est présente

10 Westerblot Cytofluorimétrie

11 Echange d’informations et d’hybridomes lors de «workshops »
Des anticorps monoclonaux différents, produits dans des labos différents reconnaissent dans certains cas la même protéine On dit alors que ces différents anticorps appartiennent au même groupe (cluster) de différenciation (CD) Chaque workshop définit ainsi les CD par ordre de description et établit pour chaque CD, les propriétés de la protéine reconnue et les cellules sur lesquelles on la trouve

12 Les anticorps monoclonaux
Les clones A3 et B1 reconnaissent la même protéine : c’est le même CD

13 De l’anticorps monoclonal à la protéine
Au fur et à mesure des workshops, on a utilisé le terme CD pour désigner les protéines membranaires elles-mêmes et donné le nom d’anticorps anti-CD aux monoclonaux correspondants

14 Immunité naturelle

15 Les « barrières »

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17 Les défenses de barrière
La peau et le sébum (rôle antibactérien des acides gras) Le mucus et « l’escalator muco-ciliaire » Les flores saprophytes (intestin, vagin, etc.) Colicine… Les milieux acides Protéines et peptides antimicrobiens

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19 Les protéines et peptides antimicrobiens
Produits par de multiples types cellulaires Glandes sous-muqueuses Cellules épithéliales Cellules « spécialisées » de l’immunité naturelle Polynucléaires neutrophiles Macrophages Selon les cas, intervention extracellulaire, intracellulaire (bactéries phagocytées) ou les deux

20 Les protéines et peptides antimicrobiens
Espoir thérapeutique (cf. résistance aux antibiotiques)

21 Les protéines et peptides antimicrobiens
Enzymes : ex. lysozyme ( mg/ml dans les sécrétions nasales, salive, larmes) Lactoferrine (chélation du fer) Défensines (feuillets b) b défensines (HBD-1 et HBD-2) Peau et tractus respiratoire a défensines (=cryptidines) Cellules de Paneth de l’intestin Cathélicidines (hélices a) Protéines A et D du surfactant (opsonines primitives)

22 Les protéines et peptides antimicrobiens
Rôle essentiel dans les défenses de première ligne Activité des défensines et des cathélicidines effondrée dans les poumons des enfants mucoviscidosiques Inhibition fréquente par hautes concentrations en sel (cf. mucoviscidose) Nouvelles approches thérapeutiques agissant sur la concentration saline du mucus Autres mécanismes?

23 La plupart des cellules de l’organisme participent à l’immunité naturelle
La plupart des cellules sont capables de “percevoir” la présence d’un microorganisme pathogène En réponse à cette perception, elles attirent sur place des cellules plus spécialisées de l’immunité naturelle (phagocytes)

24 Systèmes de perception des microorganismes pathogènes
« Signatures » (stéréotypes) moléculaires sur les microbes : PAMP (pathogen associated molecular patterns) Ne sont pas présents chez l’hôte Sont partagés par de grands groupes d’agents pathogènes Sont relativement peu variables (à la différences de l’hémagglutinine et de la neuraminidase p.ex.)

25 Exemples de PAMP (signatures)
Flagelline des flagelles bactériens Peptidoglycan des bactéries à G+ Lipopolysaccharide (endotoxine) des bactéries à G- RNA double brin DNA non méthylé

26 Récepteurs aux PAMP = PRR
Pattern recognition receptors Trois types « senseurs » membranaires ou intracellulaires Rôle dans la reconnaissance du microbe et le déclenchement de la réponse immunitaire (récepteur d’alarme) ex. Récepteurs TOLL (TLR) Sont présents sur la plupart des cellules de l’organisme « effecteurs membranaires » Déclenchent la phagocytose du microbe Uniquement présent sur les cellules « spécialisées » de l’immunité naturelle Solubles Interagissent directement avec le microbe

27 Récepteurs de la famille Toll
Les lipopolysaccharides (LPS) des bactéries Gram-, les récepteurs de la famille Toll et le CD14

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29 Lipopolysaccharide (LPS) = endotoxine
Composant du feuillet externe de la membrane des bactéries Gram- Lipide A (responsable de la toxicité) + polysaccharides Responsable du choc septique induit par les bactéries Gram – Choc septique : phénomène actif lié à la réponse de l’immunité naturelle à la toxine

30 Protéines Toll Protéines identifiées initialement chez les insectes (drosophiles) et impliquées à la fois dans le développement et dans la résistance à certaines infections Equivalent des protéines Toll chez les mammifères (toll like receptors) Les souris TLR4 KO ne font jamais de choc septique après injection de LPS!

31 des cellules phagocytaires
CD14 marqueur des cellules phagocytaires

32 Le Toll like receptor 4 appartient au récepteur du LPS
Intérêt éventuel à bloquer les signaux induits par le LPS chez les patients en choc septique

33 TLR et activation des phagocytes
le facteur NF-kb facteur transcriptionnel pivot des réponses phagocytaires

34 Famille de TLR TLR-2 : protéoglycans des Gram+ TLR-3 : dsRNA
TLR-4 : LPS TLR-5 : flagelline TLR-7 : ssRNA viral TLR-8 : ssRNA viral TLR-9 : CpG non méthylés du DNA Etc.

35 Les phagocytes 1. Polynucléaires neutrophiles (et dans une moindre mesure les polynucléaires éosinophiles) 2. Monocytes & macrophages 3. Cellules dendritiques

36 Hématopoïèse

37 1. Cellules pluripotentes
Enorme capacité d’auto-renouvellement et de différenciation

38 Cellules pluripotentes
Cellule souche myéloïde (par opposition à lymphoïde)

39 Cellule pluripotente Cellule souche myéloïde (par opposition à lymphoïde) Progénitrice commune aux neutrophiles et aux cellules mononucléées (mono/macro et cellules dendritiques)

40 Cellule pluripotente Cellule souche myéloïde (par opposition à lymphoïde) Progénitrice commune aux neutrophiles et aux cellules mononucléées (mono/macro et cellules dendritiques) Rôle des cytokines dans la différenciation : GM-CSF et G-CSF

41 Les polynucléaires ou granulocytes
un seul noyau mais polylobé (d’où le nom polynucléaire) 60 à 70% des leucocytes sanguins turnover très élevé (durée de vie courte) classification selon le type de granules Leucocytes = globules blancs (par opposition au hématies) =lymphocytes+granulocytes+monocytes

42 Les polynucléaires ou granulocytes
un seul noyau mais polylobé (d’où le nom polynucléaire) 60 à 70% des leucocytes sanguins turnover très élevé (durée de vie courte) classification selon le type de granules Lignée cellulaire très sensible lors des traitements de chimiothérapie chez les cancéreux ou leucémiques

43 Polynucléaires neutrophiles
Collagénase Lactoferrine Lysozyme Lysozyme Peroxydase autres enzymes...

44 Polynucléaires neutrophiles
ou « neutrophiles », c’est le type de polynucléaires le plus important en nombre et en fonction 1ère ligne de défense contre de nombreux types de germes tuent les microbes intracellulaires de façon plus efficace que les macrophages

45 Trois types cellules cellulaires souvent associés en pathologie
Multiples médiateurs inflammatoires Intervention dans les phénomènes allergiques et inflammatoires Polynucléaires éosinophiles, basophiles et mastocytes

46 Polynucléaires éosinophiles
Rôle dans la défense anti-parasitaire Multiples médiateurs de l’inflammation

47 Eosinophiles et inflammation

48 Polynucléaires basophiles

49 Mastocytes Cellules associées aux muqueuses, aux épithéliums et aux endothéliums (notamment veinules postcapillaires) Participent à la première ligne de défense directement (p.ex. cathélicidines) soit par attraction d’autres phagocytes (chimiotactisme)

50 Monocytes et macrophages

51 Monocytes et macrophages
Sang Tissus

52 Macrophages Poumon : macrophages alvéolaires
Tissus conjonctifs : histiocytes Rein : cellules mésangiales Foie : cellules de Küpfer Cerveau : microglie Os : ostéoclastes

53 Les cellules dendritiques

54 Les cellules dendritiques
Différents dénominations selon le site et la l’état de différenciation/activation peau et muqueuses : cellules de Langerhans organes : cellules dendritiques interstitielles organes lymphoïdes : cellules dendritiques interdigitantes sang : cellules dendritiques circulantes (veiled cells)

55 Cellules dendritiques
« Patrouillent » dans les tissus Deux fonctions différentes selon le site

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57 Phagocytes et « présentation d’antigène »
Polynucléaires neutrophiles, macrophages et cellules dendritiques sont trois types de phagocytes Les cellules dendritiques et les macrophages sont CMH II pas les polynucléaires neutrophiles donc pas de rôle des neutrophiles dans la présentation des antigènes aux lymphocytes T CD4 Les cellules dendritiques sont les plus efficaces cellules présentatrices d’antigènes aux lymphocytes T CD4+ Ne confondez pas cellules dendritiques et cellules folliculaires dendritiques (CMH II négatives et non présentatrices d’antigènes sensu stricto)

58 Macrophages et cellules dendritiques possèdent la protéine CD4
Rôle? La présence de la molécule CD4 rend les macrophages et les cellules dendritiques susceptibles à l’infection par le VIH

59 Les récepteurs des phagocytes
Trois grands types de récepteurs récepteurs pour des produits microbiens récepteurs pour des facteurs humoraux ou cellulaires qui facilitent la phagocytose récepteurs pour des ligands qui activent ou orientent les déplacements des cellules phagocytaires vers les sites inflammatoires

60 Immunité non adaptative
Reconnaissance de PAMP Pathogen Associated Molecular Patterns Structures moléculaires hautement conservées et présentes dans de larges groupes de microorganismes = stéréotypes moléculaires associés aux pathogènes

61 Récepteurs aux produits microbiens (pattern recognition receptors PRP)
Le récepteur au mannose (MR ou M/FR) et sa famille

62 Le récepteur au mannose et sa famille
Domaine de type lectine (site de la liaison au résidus mannosyl et fucosyl)

63 Lectines protéines ou glycoprotéines capable de se lier à certains résidus glucidiques origine non immunitaire capable comme un anticorps d’agglutiner ou de précipiter des cellules ou des glycoconjugués isolées initialement chez des végétaux mais molécules voisines (lectin-like) présentes chez les bactéries et les animaux

64 Le récepteur au mannose et sa famille
Domaine de type lectine (site de la liaison au résidus mannosyl et fucosyl) Liaison à de nombreux microorganismes Gram-, Gram+, mycobactéries, champignons, parasites

65 Récepteur f-Met-Leu-Phe
Récepteurs pour peptides N-formylés de nombreuses bactéries Récepteur chimiotactique

66 Récepteurs aux PAMP avec propriétés différentes
Récepteur au mannose : phagocytose Récepteurs Toll : signal d’activation Récepteur FMLP : chimiotactisme

67 Récepteurs pour des facteurs humoraux de la réponse immunitaire
Opsonines-opsonisation opsonein : je prépare le repas Facilitation de la phagocytose des microorganismes par des produits humoraux de la réponse immunitaire (immunoglobulines ou fragments du complément activé)

68 Récepteurs pour des facteurs humoraux de la réponse immunitaire
Récepteurs pour l’extrémité Fc (cristallisable ou constant) des immunoglobulines Portion Fc

69 Récepteurs pour des facteurs humoraux de la réponse immunitaire
Récepteurs pour l’extrémité Fc des immunoglobulines Selon la classe d’immunoglobuline reconnue (IgG, ou IgE), les récepteurs (FcgR, FceR) ont des structures et des distributions cellulaires différentes

70 Récepteurs pour des facteurs humoraux de la réponse immunitaire
Récepeurs pour des fragments du complément activé CR1 CR3

71 Le processus de phagocytose
Quatre étapes chémotactisme adhésion phagocytose (sensu stricto) microbicidie oxydative non-oxydative

72 Phagocytose Phénomène actif et consommateur d’énergie
Efficacité accrue par l’opsonisation

73 Microbicidie (ou bactéricidie) intracellulaire
Deux mécanismes différents phénomènes oxydatifs dépend de la production d’intermédiaires réactifs de l’oxygène qui ont un rôle microbicide phénomène inductible : « explosion respiratoire » phénomènes non oxydatifs dépend de la production de peptides antibactériens

74 Microbicidie oxydative
Myélopéroxydase NO synthase NADPH oxydase

75 Microbicidie oxydative
Dépendance du NADPH fourni par le shunt des pentoses

76 Microbicidie oxydative
NO : nombreuses fonctions indépendantes de son rôle microbicide

77 Microbicidie oxydative
Phénomènes qui consomment beaucoup d’énergie et sont donc sensibles aux maladies où l’apport cellulaire en énergie est perturbé : diabète mal équilibré Dans certaines maladies génétiques, une des trois enzymes est déficiente : les germes prolifèrent à l’intérieur des phagocytes, ce sont les maladies granulomateuses chroniques

78 Microbicidie oxydative
Phénomènes qui consomment beaucoup d’énergie et sont donc sensibles aux maladies où l’apport cellulaire en énergie est perturbé : diabète mal équilibré Dans certaines maladies génétiques, une des trois enzymes est déficiente : les germes prolifèrent à l’intérieur des phagocytes, ce sont les maladies granulomateuses chroniques

79 Microbicidie oxydative
A l’état de repos, les macrophages et monocytes sont généralement moins efficaces que les polynucléaires neutrophiles pour la microbicidie oxydative et dépendent étroitement de l’aide des lymphocytes T

80 Microbicidie non oxydative
existent aussi souvent dans les sécrétions Enzymes microbicides Hydrolases : lysozyme (muramidase) : destruction de la paroi bactérienne des G+; glycosidases, lactoferrine, élastase, cathepsines Protéines cationiques : « protéines antibiotiques » défensines : petites molécules (29-35 aa) possédant trois ponts disulfures et dont l’activité est inhibée quand la concentration en sels (Cl-) est trop élevée

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82 Exocytose processus alternatif mis en place par les macrophages et les polynucléaires neutrophiles quand la phagocytose est impossible moins sélective moins efficace processus principal d’autres types cellulaires comme les polynucléaires éosinophiles et basophiles

83 Polynucléaires éosinophiles

84 Polynucléaires éosinophiles
Dégranulation : produits à activité antiparasitaire IgE FceR

85 Cytotoxicité (à médiation cellulaire)
Lymphocytes T cytotoxiques CD8+ Cellules tueuses naturelles (natural killer ou NK) Cellules K et phénomène ADCC

86 Lymphocyte T cytotoxique (CD8+)
Polarisation et exocytose dépendent d’un accroissement du [Ca++] i dans le lympho. cytotoxique

87 Deux constituants dans les granules
Perforines forment des trous dans la membrane de la cellule cible (comme le complément) Sérine Protéases (granzymes)

88 Perforines des lymphocytes T cytotoxiques

89 Deux voies d’induction de l’apoptose de la cellule cible

90 Deux voies d’induction de l’apoptose de la cellule cible
A la différence des autres lymphocytes les lymphocytes T cytotoxiques activés expriment le Fas ligand

91 Lymphocyte T cytotoxique
1. Il entre en contact avec sa cible 2. La reconnaissance spécifique de l’antigène + MHC I déclenche un accroissement du calcium intracellulaire 3. Les granules se polarisent puis se vident à l’interface avec la cellule cible 4. Les monomères de perforine se polymérisent et forment des trous dans la cellule cible 5. Les sérines protéases (granzymes) entrent par ces trous et en synergie avec l’interactions Fas/Fas ligand déclenchent l’apoptose de la cellule cible

92 Lymphocyte T cytotoxique
Le lymphocyte cytotoxique ne tue pas la cellule cible, il la contraint surtout à se suicider...

93 Les cellules tueuses naturelles (NK)

94 Les cellules tueuses naturelles
Toujours prêtes : pas besoin de sensibilisation, ni de différenciation préalables... Mécanismes lytiques (perforines et granzymes) les mêmes que ceux des lymphocytes T cytotoxiques

95 Cellules NK Cellules de la lignée lymphoïde mais qui ne sont
ni B (pas d’Ig de membrane ou cytoplasmique) ni T (pas de TCR)

96 Quel type de cellules reconnaissent les NK?
Cellules infectées Cellules tumorales Parasites

97 Comment ça marche?

98 Base moléculaire de la discrimination par les cellules NK
comment reconnaître une cellule transformée ou infectée par un virus quand on n’a pas de TCR? première piste : la cellule NK reconnaît une sorte de PAMP à la surface de ces cellules... 20 ans de recherche, jamais rien trouvé de tel!

99 Base moléculaire de la discrimination par les cellules NK
comment reconnaître une cellule transformée ou infectée par un virus quand on n’a pas de TCR? deuxième piste : la cellule NK perçoit l’absence d’une structure normalement présente sur les cellules de l’organisme

100 Les récepteurs KIR (Killer Inhibitory Receptors)

101 La perte des molécules MHC est un moyen fréquemment utilisé par les cellules tumorales ou par les cellules infectées par des virus pour échapper au contrôle des lymphocytes T cytotoxiques CD8+ ...

102 cela rend les cellules en question plus sensibles à l’activité des NK
cela rend les cellules en question plus sensibles à l’activité des NK. L’évolution a conservé les NK aux côtés des lymphocytes T cytotoxiques pour contrecarrer les mécanismes d’échappement des virus...

103 « Cellules K » et ADCC ADCC = antibody dependent cell-mediated cytotoxicity

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105 « Cellules K » et ADCC ADCC = antibody dependent cell-mediated cytotoxicity Les cellules K correspondent à une fonction particulière que peuvent exercer plusieurs types cellulaires (NK, macrophages, polynucléaires) Les cellules K ne sont pas une lignée en soi

106 Conclusion Immunité naturelle
Première ligne de défense contre les agents infectieux Rôle fondamental dans l’initiation des réponses adaptatives Réponses peu ciblées, stéréotypées Inflammation

107 Inflammation L’inflammation est souvent le reflet d’une activation de l’immunité naturelle