La méthode enzymatique de séquençage, dite de (Sanger; didésoxy)

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1 La méthode enzymatique de séquençage, dite de (Sanger; didésoxy)
Méthode de synthèse partielle basée sur l'arrêt de la synthèse par l'incorporation de didésoxynucléotides Nécessite: Brin simple matrice Amorce ADN polymérase (Klenow) Déoxynucléotides Didéoxynucléotides

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3 d                                                                                                                            

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5 Le séquençage automatique
3’ Sens de la lecture sur un autoradiogramme 5’

6 Recherche de la phase ouverte de lecture ou cadre de lecture ouvert (ORF: open reading frame)

7 Clonage de l'ADN génomique

8 Utilisation du phage lambda comme vecteur de clonage
La partie centrale du phage lambda n'est pas nécessaire pour la réplication ou l'encapsidation Environ 15 kb

9 Autres vecteurs de clonage
1) Cosmides Hybride phage / plasmide Peut cloner environ bases 2) Phage à brin simple, p. ex., M13 Phage à ADN circulaire (7.2 kb); Brin double dans E. coli; Brin simple à l'extérieur d'E. coli Production de brin simple des gènes clonés pour le séquençage (avant les techniques de séquençage par RPC) 3) Vecteurs d'expression Plasmides où le gène cloné est transcrit et traduit en protéine 4) YAC - Chromosome artificiel de levure Télomères et centromère Peut cloner environ bases 5) BAC - Chromosome artificiel de bactérie Construit à partir du facteur F Peut cloner environ bases

10 Comment repérer ou identifier le clone contenant le gène voulu?

11 A noter que, ce protocole peut-être utilisée avec des plages de lyse ou des colonies.
Incubation de la membrane de nitrocellulose avec une sonde radioactive. La sonde radioactive est un fragment d’ADN spécifiquement complémentaire à l’ADN du gène recherché. La sonde est marquée à la radioactivité ou par fluorescence. Encore faut-il préparer une sonde spécifique au gène recherché!

12 Comment obtenir des sondes spécifiques
Comment obtenir des sondes spécifiques? Hybridation des brins d'ADN complémentaires. 1) Sonde à partir du gène d'une autre espèce 2) Sonde à partir d'ADN complémentaire A T C G G T A T C G G T + G C T A C A GC T A CA *CCGTAC = sonde G G C A T G *C C G T A C G G C A TG

13 Sonde d'ADN synthétique
Sonde d'ADN synthétisée à partir de la connaissance des acides aminés d'une protéine produite par le gène + utilisation du code génétique

14 Synthétiseur d’oligonucléotides

15 Oligonucléotides On peut synthétiser des fragments d'ADN de 10 à 100 bases de longs. On peut les rendre radioactifs et s'en servir comme sondes. On se sert de transférase terminale pour ajouter des dNTPs ayant du 32P sur leur phosphate gamma ACTGCTGATCGTAGCTA*A*A*A*

16 Autre type de sondes: les sondes d'anticorps
La protéine est détectée à l'aide d'un anticorps primaire qui reconnaitera spécifiquement la protéine étudiée, puis d’un anticorps secondaire fluorescent et qui s’attachera à l’anticorps primaire.

17 Comparaison de deux vecteurs de clonage (1976 versus 1982)
Des fragments grands jusqu’à environ 10kb peuvent être clonés.

18 Construction d'une librairie de clones
109 Fragments/EcoRI Plasmides/EcoRI Ligation 108 Plasmides Recombinants cellules Transformation 10 x 106 Cellules ayant un plasmide recombinant = colonies blanches en présence de X-GAL + 90 x 106 Cellules ayant un plasmide non-recombinant = colonies bleues en présence de X-GAL x 106 Cellules n'ayant aucun plasmide = pas de colonies en présence d'ampicilline

19 Clonage par positionnement - Arpentage du chromosome (marche sur le chromosome)

20 Buvardage (transfert) de Southern

21 Hybridation avec une sonde radioactive lors d'un transfert de Southern

22 Buvardage (transfert) Northern
Transfert capillaire servant à déceler la présence d'un ARN déterminé Différences comparé à un Southern: 1 - Pas d'enzyme de restriction 2 - Le gel contient une substance dénaturante pour empêcher la formation de structure secondaire ARN = 1 seul brin 3 - Pas de dénaturation et neutralisation du gel avant le transfert Similairement, le transfert servant à détecter la présence d'une protéine est appelé Western blot. Dans un Western, La protéine est détectée à l'aide d'un anticorps primaire qui reconnaitera spécifiquement la protéine étudiée, puis d’un anticorps secondaire fluorescent et qui s’attachera à l’anticorps primaire.

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24 Problème de carte de restriction
Un chromosome linéaire de phage est marqué au 32P à ses deux extrémités et digéré par l’enzyme EcoRI. Ceci produit des fragments de 2.9, 4.5, 6.2, 7.4 et 8.0 kb. Une autoradiographie d’un buvardage à la Southern du gel contenant ces fragments montre que la radioactivité est associée aux fragments de 6.2 et de 8.0 kb. L’enzyme BamHI coupe le même ADN en fragments de 6.0, 10.1 et 12.9 kb. Dans ce cas le marquage est associé aux fragments de 6.0 et de 10.1 kb. Lorsque EcoRI et BamHI sont utilisés ensemble les fragments obtenus mesurent 1.0, 2.0, 2.9, 3.5, 6.0, 6.2 et 7.4 kb.

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26 A) Dessinez la carte de restriction de cette molécule par ces deux enzymes en y indiquant les positions relatives et les distances. B) Une sonde radioactive préparée à partir d’un gène X cloné de ce phage est ajoutée à un filtre obtenu par buvardage d’un gel contenant l’ADN du phage, cette fois non marqué, digéré par les enzymes pris séparément. L’autoradiographie montre qu’il y a hybridation avec les fragments de 4.5, 10.1 et 12.9 kb. Dessinez la localisation du gène X sur votre carte.

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