Virus recombinant et vaccination

Présentation au sujet: "Virus recombinant et vaccination"— Transcription de la présentation:

1 Virus recombinant et vaccination
Exemple de la rage FLICOTEAUX Pascal GARCON Sylvain

2 Rhabdovirus RNA monocat-, Kb Une seule glycoprotéine: G

3 Principe Le but est d’insérer le gène codant pour la glycoprotéine rabique dans un virus (virus de la vaccine) L’ensemble est injecté, la glycoprotéine est exprimée immunisation

4 Préparation de l’insert
Etape 1: excision de la queue polydG ATG TAC ATG TAC ATG Oligonucléotide double brin TAC ATG= codon initiateur

5 Préparation de l’insert
Etape 2: correction de l’aa n°8 CTA ATG GAT TAC CCA GGT CCA ATG GGT TAC Hind III

6 Préparation du plasmide
tk ADN viral Hind III Gène Thymidine kinase tk clonage

7 Préparation du plasmide
tk Promoteur précoce + tk insert + Tk - Hind III

8 Production de virus recombinant
Ca2+ Insert Géne nts Virus vaccinal ts Culture de cellule Ts = thermosensible, nts = non ts

9 Sélection des recombinants
Incubation à température non permissive Recombinants nts Culture de cellule

10 Sélection des recombinants
Culture sur cellules tk - Recombinants nts et tk- Culture de cellule + BrdUrd BrdUrd = substrat tk

11 Vérification Digestion ADN par Hind III Electrophorèse:
2 fragments (1,1 + 5,5 Kb): OK Si 1 fragment (4,6 Kb): non recombinant Southern blotting: hybridation avec DNA de la glycoprotéine rabique

12 Préparation du plasmide
tk Promoteur précoce + tk insert + Tk - Hind III

13 Essais in-vitro Infection cellules tk-
Forte immunofluorescence avec des Ac anti-gp La synthèse est donc efficiente Immunoprécipitation: par sérum polyclonal autant que par 2 Ac monoclonaux (bande à PM de 66000: correspond à la glycoprotéine rabique)

14 Essais in-vivo Injection intra-dermique chez la souris: résiste à des épreuves d’infection à haute dose

15 Conclusion La glycoprotéine produite est qualitativement indistingable de la protéine native Les virus atténués comme le virus vaccinal sont des vecteurs particulièrement appropriés pour la production de vaccins (à été utilisé pour smallpox, hépatite B, influenza et herpès)

16 Biblio Kieny M.P. et al., 1984 : expression of rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus. Nature, 312, Blancou J. et al., 1986 : oral vaccination of the fox against rabies using a live recombinant vaccinia virus. Nature, 322, Pastoret P.P. & Brochier B., 1996: the developement and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur. Epidemiol. Infect., 116,