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Publié parCamille Benoist Modifié depuis plus de 11 années
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III. Substrats sonde pour l’étude des mécanismes enzymatiques CP450 (suite)
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CP450, mécanisme
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Mécanisme concerté vs. 2 étapes
Pas de transposition allylique et rétention de configuration >90%
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Mécanisme concerté vs. 2 étapes
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Mécanisme concerté vs. 2 étapes
+
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Horloges radicalaires
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Horloges radicalaires
Pas de transposition
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Nitroxyl radical coupling
K. U Ingold
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Barton’s PTOC
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Calibration d[R’]/dt = k1[U’] - k-1[R’] - k[R’][P]
k1[U’]/k[R’][P] - k-1[R’]/k[R’][P] = 1 k1[U’]/k[R’][P] = 1 k1 = k[R’][P]/[U’] k1 = k[R][P]/[U]
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Calibration
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CP450, mécanisme radicalaire?
d[U’]/dt = k[1] - kreb.[U’] - kR[U’] d[R’]/dt = kR[U’] - kreb.[R’] = 0 ; [U]/[R] = [U’]/[R’] kreb. = kR[U’]/[R’] = kR[U]/[R] = x 7/1 = s-1
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Horloges radicalaires
Les rapides Les très rapides
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Horloges radicalaires
<kOH<
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Pourquoi cet écart? Mécanisme mal modélisé
2) Calibration des horloges pas présise 3) Effet stérique et effet de la protéine sur le réarraangement kOH = 1013 s-1
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Il faut remettre les pendules à l’heure
<kOH<
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Les horloges ne donnent pas la bonne heure!!!!!
s-1 > à la vitesse de décomposition d’un état de transition Trop rapide pour l’existence d’un intermédiaire
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Et M. Newcomb propose un mécanisme avec un C+
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A la recherche d’une horloge à C+
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A la recherche d’une horloge à C+
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A la recherche d’une horloge à C+
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Mécanisme avec un ion carbénium?
1 à 3%
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M. Newcomb persiste et signe
Si radical temps de demie vie de s (trop court pour un intermédiaire) Si radical rapport B/C plus grand Conclusion : mécanisme avec insertion directe de « OH » avec réaction secondaire
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0.6%
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Nouveau mécanisme
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Effet isotopique kH/kD
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Effet isotopique kH/kD
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2 1
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CP450, deux oxydants possibles
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CP450, deux oxydants possibles
Insertion de « O » Hydroxylation Insertion de « OH » Responsable de la formation des produits transposés
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CP450, deux oxydants possibles
Insertion de « O » Hydroxylation Insertion de « OH » Responsable de la formation des produits transposés
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Epoxydation des oléfines
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Substrat-suicide
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Vérification des hypothèses appel à la biologie moléculaire
Mutant thréonine Alanine (T303A)
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Hydroxylation vs. epoxydation
FeV=O FeIIIOOH Vitesse de réactions nmole/min/nmole de P450 P450 T303A
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Hydroxylation vs. epoxydation
FeV=O FeIIIOOH Vitesse de réactions nmole/min/nmole de P450 P450 T303A
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Et avec les horloges? Hydroxylation
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Hydroxylation des aromatiques, NIH shift
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Hydroxylation des aromatiques, NIH shift
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Et avec les horloges? Rapport R/U élevé Rapport R/U faible
Hydroxylation Rapport R/U élevé Rapport R/U faible
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Effet isotopique kH/kD
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M. Newcomb, le retour Pas de radical!!!!!!!
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Comment Shaik arrive à réconcilier tout le monde
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Shaik serait-il normand?
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Low Spin vs. High Spin • HS LS
49
Calculs DFT
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Low Spin vs. High Spin
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CP450, mécanisme radicalaire?
fuite kreb. = kR[U’]/[R’] = kR[U]/[R] = x [U]/[R]
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Oxydation des amines
54
Oxydation des amines
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