Les propriétés cinétiques de l'aspartate transcarbamylase - jour 2

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1 Les propriétés cinétiques de l'aspartate transcarbamylase - jour 2
Carbamyl phosphate carbamylaspartate ATCase

2 BCM311 - rappel comportement
embouts boite vide boîte moitié vide - retourner au buffet - remplir (gants) et mettre à l'endroit pour stérilisation ultérieure (ne pas remettre au buffet)

3 BCM311 - rappel comportement
remplir flacons laveurs vider poubelles de table enlever cuvettes des spectrophotomètres ne pas laisser des cuvettes pleines sous la hotte départs hâtifs - manipulations - ménage - vérification du cahier

4 Jour 1 - variabilité

5 Jour 1 - allostérie R2 = 0,9933 R2 = 0,9893 R2 = 0,9961 R2 = 0,9997

6 Jour 1 - faibles préparations

7 ATCase est une enzyme allostérique
ATCase - but ATCase est une enzyme allostérique 1ère semaine - préparation de l'enzyme détermination de la dilution étudier les propriétés cinétiques de aspartate transcarbamylase (ATCase) d'E. coli vitesse

8 Organigramme - semaine 2
effecteurs d’ATCase (séries A, B et C) Préparation d’ATCase de la première semaine Dosage d’ATCase sans effecteur (Série A) Dosage d’ATCase en présence de CTP (Série B) Dosage d’ATCase en présence d’ATP (Série C) Courbe standard de carbamyl aspartate

9 Organigramme - semaine 2
désensibilisation du site allostérique (A,D+E) Préparation d’ATCase de la première semaine Dosage d’ATCase sans effecteur (Série A) Dosage d’ATCase en présence de Hg (Série D) Dosage d’ATCase en présence de Hg + CTP (Série E)

10 Organigramme - semaine 2
effecteurs d’ATCase (séries A, B et C) Préparation d’ATCase de la première semaine Dosage d’ATCase sans effecteur (Série A) Dosage d’ATCase en présence de CTP (Série B) Dosage d’ATCase en présence d’ATP (Série C) Courbe standard de carbamyl aspartate

11 Biosynthèse des pyrimidines
CTP est un inhibiteur d'ATCase ATP est un activateur d'ATCase assure une production égale de purines + pyrimidines

12 Vmax ne change pas Kprime change ATCase
À noter: ►Kprime n'est pas la [S] à Vmax/2 ►ici à titre d'exemple seulement +CTP +ATP Vmax ne change pas Kprime change

13 ATCase enzyme allostérique: cinétique non-michaelienne

14 BCM311 - résultats typiques
+CTP +ATP

15 Michaelis-Menten d'ATCase

16 Organigramme - semaine 2
désensibilisation du site allostérique (A,D+E) Préparation d’ATCase de la première semaine Dosage d’ATCase sans effecteur (Série A) Dosage d’ATCase en présence de Hg (Série D) Dosage d’ATCase en présence de Hg + CTP (Série E)

17 Structure d'ATCase - séries A, D + E
enzyme native, C6R6, 300 kDa

18 Structure d'ATCase - séries A, D + E
sous-unité catalytique (C3) catalysent encore la réaction souvent plus active que l’holoenzyme cinétique michaelienne (courbe hyperbolique) pas sous la régulation de CTP ou d’ATP

19 Structure d'ATCase - séries A, D + E

20 Structure d'ATCase - effet de Hg
ATCase+Hg plus active que natif courbe hyperbolique ATCase ne répond plus à CTP

21 Structure d'ATCase - effet de Hg

22 Structure d'ATCase - effet de Hg
ATCase+Hg plus active que natif courbe hyperbolique ATCase ne répond plus à CTP

23 Points techniques préparer suffisamment d’enzyme diluée pour effectuer les séries en question (A-C ou A+D+E) diluer l’enzyme immédiatement avant son utilisation garder l’enzyme sur glace en tout temps sauf durant l’incubation

24 Lunettes et gants obligatoire
Points techniques Lunettes et gants obligatoire préparer le réactif (attention: H2SO4) colorimétrique juste avant son utilisation (protège-le de la lumière) préparer seulement le volume du réactif requis (~210 ml; surplus à Will) lire les DO rapidement après la terminaison des réactions: la couleur diminue avec le temps

25 Points techniques Réactions à 30oC (bains personnels) réactifs (tubes) préchauffés laissez des intervalles assez longs vérifiez la température des bains

26 préparation des solutions
Points techniques préparation des solutions aspartate 125 mM (préparer 50 ml / table) carbamyl phosphate 36 mM (préparer 50 ml / table) solutions préparées semaine I acide perchlorique 2% tampon sodium phosphate 0,16 M pH 7,0

27 Points techniques Études cinétiques = précision chronométrage concentrations/dilutions/volumes homogène température

28 ATCase - questions ? Carbamyl phosphate carbamylaspartate aspartate

29 ATCase - graphique de Hill
log (V/Vmax-V) vs log [aspartate] pente = nh besoin de Vmax Vmax historiquement déterminé à l’aide des graphiques "linéaires" de Lineweaver-Burk et d'Eadie-Hofstee

30 ATCase - graphique de Hill
pour un enzyme allostérique, la courbe M+M est sigmoïde

31 ATCase - graphique de Hill
alors, les graphiques linéaires (LB et EH) ne sont pas Comment déterminer Km et Vmax ?

32 Régression non-linéaire ("Curve fitting")
logiciels puissants (Graphpad) utilise le formule MM pour les enzymes allostériques et détermine Vmax, Kprime et nH pour que la courbe tracée suit les données

33 Régression non-linéaire ("Curve fitting")
native +CTP +ATP

34 GraphPad 6 - utilisation dans BCM311
présentation PowerPoint disponible sur le site internet du cours régression linéaire (courbe standard) régression non-linéaire (Michaelis-Menten) comparaison de modèles (ex. MM vs sigmoïde)

35 Analyse des données - Excel
préparez une « super » tableau avec toutes les données AVANT de faire les graphiques pour une série (ex. Série A) bien identifier les colonnes (unités etc.) copiez le tableau, changez les DO et tous les calculs se fait automatiquement pour la 2e série

36 Analyse des données - Excel

37 Analyse des données - Excel
1 µM = 1 µmole/L volume de réaction = 2 ml = 2 x 10-3 L Alors: µmole CA = µM x 2 x 10-3 L

38 Analyse des données - Excel
= µmoles CA / (0,5 hr X 0,1 ml)

39 Analyse des données - Excel

40 Analyse des données - Excel
Série A Série B

41 Cette semaine nouvelle courbe standard chaque équipe analyse ses propres résultats analyse des résultats (graphiques MM) avec GraphPad en fin de journée (fichier à Will) rapport à remettre dans 2 semaines