ECUE Méthodologie de la Génétique Moléculaire

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1 ECUE Méthodologie de la Génétique Moléculaire
TD : Claire Darzac Mise en évidence et cribles basés sur des interactions protéiques Cours sur le FRET Maïté Coppey : 12/10 TD : Sandrine Caburet Cribles basés sur des critères d’expression différentielle Cours sur la PCR quantitative Thierry Grange 19/10 Mutagenèse insertionelle chez la drosophile transgenèse Vecteurs Mutagenèse Perte et gain de fonction TD : Alain Zider

2 Mise en évidence d’interactions protéiques par des méthodes biochimiques
Test d’interaction GST Co-immunoprécipitation Cribles permettant d’identifier des partenaires protéiques Criblage d’une banque d’expression dans lambda GT11 Clonage de molécules de surface par expression transitoire Le système double hybride Le phage display Protéomique et interaction protéique

3 rinçages Culture de bactéries Lysat bactérien plac
Extraction protéique GST X Lysat bactérien M marquage métabolique produit de transcription traduction Analyse sur gel SDS page rinçages

4 Analyse sur gel SDS PAGE
Culture de bactéries Analyse sur gel SDS PAGE plac plac GST X GST Extraction protéique rinçages

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6 Co-immunoprécipitation
Extrait cellulaire Anticorps anti X Protéine A sépharose Dénaturation et analyse sur gel SDS page M Ig Y Mise en évidence Y Coloration à l’argent Anticorps anti Y Marquage métabolique methionine35S Cartographie peptidique par spectrométrie de masse X

7 Criblage d’une banque d’expression dans lGT11

8 Criblage d’une banque d’expression dans lGT11

9 étalement Transfection dans des bactéries
banque de cDNA construite dans un vecteur d’expression eucaryote Cellules cos Expression transitoire Incubation avec un premier anticorps étalement isolement de l’ADN épisomal Transfection dans des bactéries Analyse des cDNA (séquençage)

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12 Gal4 AD LexA LacZ Lex op

13 Prom. DLA Apat trp Rapporteur His Prom. DAT Proie leu 2µ 2µ 2µ LexA
DLA gal4 Prom. DLA Apat DAT PolyA Proie Apat ampiciline DLA trp Rapporteur 2µ PolyA Ori coli ampiciline lacZ met DAT Gal4 VP16 B42 His 2µ Ori coli Prom. DAT Proie PolyA ampiciline leu 2µ Ori coli

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15 stratégie de contre sélection

16 5’ fluoroorotic acid 5’ fluorodexoxyuridine Thymidilate synthase DNA synthesis

17 Mise en évidence d’une interaction Protéine ARN
(phage MS2) Apat ARN phage MS2

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20 Transformation dans E.Coli (sup ambre)
Phage rescue purification des phages et passage sur colonne d'affinité rinçages élution Ré-infection de bactéries et isolement des plasmides

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27 Co-Immunoprécipitation

28 RNA biotinylés Spliceosome humain Identification par
Analyse en gel bidimensionnel Identification par Spectrométrie de masse Isolement du cDNA correspondant Expression d’une protéine chimère 41-GFP Anti corps anti -U1-snRNP 41-GFP Transfection dans des celllules HeLa