LE SEQUENCAGE.

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1 LE SEQUENCAGE

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9 OPTIMISATION DE LA RÉACTION DE SEQUENCE
 QUALITE DE LA MATRICE - Produit de PCR : Purification (élimination des amorces, dNTP) - Kit de purification ( colonnes Qiagen – Sigma …) - Traitement à l’ExoSAP Mélange de 2 enzymes : Exonucléase 1 (élimine les amorces) Phosphatase Alcaline (élimine les dNTP) - Plasmide : Purification - Kit de purification - Quantification - Dépôt sur gel d’agarose avec marqueur de taille - Nanodrop

10 OPTIMISATION DE LA RÉACTION DE SEQUENCE
 REACTION DE SEQUENCE - Instructions du fournisseur - Quantité d’ADN - Volume du mélange réactionnel - Quantité d’amorce - Cycles 94°C 3 min (96°C 10sec- 50°C 5 sec - 60°C 4 min) 25x Volume total = 25 µl ADN (PCR) = 5 ng Amorce = 3 pmoles Tampon 5X = 2,5 µl Kit Big Dye = 1 µl H2O = qsp 25 µl Kit Big Dye contient : ADN Polymérase Tampon MgCl2 dNTP ddNTP*

11 OPTIMISATION DE LA RÉACTION DE SEQUENCE
 PRECIPITATION DES SEQUENCES - Instructions du fournisseur - Précipitation éthanolique NaAc 3M pH 4,6 + EtOH 95% Lavage EtOH 70% - Purification sur billes magnétiques (Agencourt)

12 - Purification sur billes magnétiques (Agencourt)

13 SEQUENCEUR CAPILLAIRE

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18 LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

19 LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

20 LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

21 LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

22 LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

23 LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

24 POURQUOI ANALYSER UNE SEQUENCE ?
A partir de la structure d’un gène, déterminer la séquence codante et en déduire la séquence protéique Trouver des homologies : Au niveau des gènes d’une même famille Au niveau d’un même gène dans différentes espèces Trouver des différences : Polymorphismes Mutations  Alignement de séquences (Logiciel SeqScape)

25 LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

26 LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

27 LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

28 EXON 9 Homozygote A/A Hétérozygote A/G Homozygote G/G

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30 Exemple de séquence avec intensité de fluorescence saturante
en haut, temps d’injection standard ; en bas, temps d’injection diminué de moitié (onglet Raw, ne pas dépasser 4000 en intensité) 16 et 17/02/2005 : 190_1L

31 Exemple de séquence avec intensités de fluorescence saturantes
Même tube de séquence : en haut, temps d’injection standard ; en bas, temps d’injection diminué de moitié 16 et 17/02/2005 : 190_1L

32 Exemple de séquence avec amorce partiellement dégradée : n-1, n-2, n-3
Run 633, 191_13 et 31_13R

33 Exemple de séquence avec amorce partiellement dégradée : n-1, n-2, n-3
Run 633, 191_13 et 31_13R

34 Exemple de séquence à partir d’un produit PCR contaminé par les amorces PCR :
superposition des séquences sens et antisens.

35 LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS
Mutation Faux-Sens  Modifie l’acide aminé - Vérifier s’il s’agit d’un acide aminé conservé - Vérifier si la classe de l’acide aminé change Mutation Non Sens  L’acide aminé est remplacé par un Stop - Stop prématuré  production d’une protéine tronquée Mutation d’épissage - Au niveau du site donneur - Au niveau du site accepteur - Insertion/Délétion  Décalage du cadre de lecture Mutation silencieuse  Ne modifie pas l’acide aminé - Mutation intronique

36 LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS
Mutation Faux-Sens ATA  GTA (IleVal) c.1336A>G p.I446V

37 LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS
Mutation Non Sens CGA  TGA (Arg  Stop) c.2587C>T p.R863X Production d’une protéine tronquée

38 LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS
Délétion/Insertion Séquence normale : TCA GCA GAC TTT GTG GTG GAG GCT Séquence mutée TCA GCA GAC TGT GGT GGA GGC TAT Séquence normale : TCA GCA GAC TTT GTG GTG GAG GCT ATC GGG GAC GAC GTG GGC Séquence mutée : TCA GCA GAC TGT GGT GGA GGC TAT CGG GGA CGA CGT GGG CAC GCT GGG CTT CTC GGT GGA AGG GCC ATC GCA GGC TAA Délétion de 2 pb : c.1790_1delTT p.Phe597CysfsX23

39 LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS
Mutation d’épissage Intron 12 - c T>G

40 SEQUENCE CONSENSUS DU SITE DONNEUR D’EPISSAGE
EXON INTRON %A %T %C %G A G G T A A G T

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44 CONSEQUENCES D’UNE MUTATION D’EPISSAGE
GT AG Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 9 Exon 10 Exon 11 GT AG Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 9 Exon 10 Exon 11

45 LOGICIELS D’ANALYSE : SEQUENCE NAVIGATOR
- Mise en évidence de mutations A  G Modification du site accepteur d’épissage

46 SEQUENCE CONSENSUS DU SITE ACCEPTEUR D’EPISSAGE
INTRON EXON %A %T %C %G Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y N Y A G G Polypyrimidine track (Y = T ou C; N = n’importe quelle base)

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49 CONSEQUENCES D’UNE MUTATION D’EPISSAGE
GT AG Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 9 Exon 10 Exon 11 GT AG AG AG AG Exon 9 Exon 11 Exon 9 Exon 10 Exon 9 Exon 11

50 LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS
Mutation silencieuse Homozygote G/G Hétérozygote G/A Homozygote A/A Exon 2 – c.111G>A p.Thr37Thr

51 LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS
Mutation intronique Homozygote T/T Hétérozygote T/C Homozygote C/C Intron 2 – c.83-29G>A

52 LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS
Vérifier la présence de la mutation chez les parents du malade et d’autres membres de la famille - Mutation Faux-Sens - Vérifier s’il s’agit d’un acide aminé conservé - Vérifier si la classe de l’acide aminé change - Mutation Non Sens - Stop prématuré  production d’une protéine tronquée - Vérification par Western Blot - Mutation d’épissage - Vérification par RT-PCR - Insertion/Délétion  Décalage du cadre de lecture Mutation silencieuse ou intronique - Vérifier s’il s’agit d’un polymorphisme - Répertorié dans les banques de données - Tester 50 à 100 individus contrôle

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54 Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 9 Exon 11 Exon 9
AG GT 250 N Ht Hm Exon 9 Exon 10 Exon 11 50 pb 150 pb 250 100 Exon 9 Exon 11 250 ??? Exon 9 Exon 10 Exon 11 250 ??? Exon 9 Exon 11

55 Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 9 Exon 10 Exon 11
AG GT 250 N Ht Hm Exon 9 Exon 10 Exon 11 50 pb 150 pb 50 pb 250 ??? Exon 9 Exon 10 Exon 11

56 ANALYSE DE MARQUEURS MICROSATELLITES
LOGICIEL GENEMAPPER

57 Marqueur Microsatellite : Segment d’ADN contenant des répétitions en tandem de courts
motifs de 2,3 ou 4 nucléotides. Très nombreux, dispersés sur tout le génome, ils sont le siège de variations à l’origine de polymorphismes multialléliques très informatifs

58 LOGICIELS D’ANALYSE : GENE MAPPER
 Analyse de marqueurs microsatellites - PCR : une des amorces marquée par un fluorochrome (6FAM) - Produit de PCR fluorescent - Mélange du produit avec un marqueur de taille (35 à 350 pb) marqué par un autre fluorochrome - Séparation des fragments sur séquenceur capillaire - Détection des fragments fluorescents - Analyse des données

59 LOGICIELS D’ANALYSE : GENE MAPPER
Exemple : Mise en évidence d’une délétion sur le chromosome 11 chez un patient par FISH Déterminer les bornes de la délétion par analyse des marqueurs microsatellites de la région Choix de 5 marqueurs Réalisation des PCR sur l’ADN du patient et de ses parents Séparation des fragments sur séquenceur capillaire Analyse par GeneMapper C T D11S4135 D11S4147 D11S1354 D11S1795 AP001791 AP001984 AP003305 AP002797 AC023118 AP002751 AP002370 AP000773 AP003026 AP000446 D11S873 D11S1775 D11S4187 D11S1306 AP000852 AP001825 AP000857 AP000639 AP003093 AP003095 AP002803

60 D11S4187

61 D11S1775

62 D11S873

63 D11S4135

64 D11S4147

65 LOGICIELS D’ANALYSE : GENE MAPPER
 Exemple d’analyse de marqueurs microsatellites - Mise en évidence d’une microdélétion d’origine paternelle Cen D11S4187 D11S1775 D11S873 D11S4135 D11S4147 Tél - 173 - 236 P M D

66 D11S4135 D11S4147 D11S1354 D11S1795 AP001791 AP001984 AP003305 AP002797 AC023118 AP002751 AP002370 AP000773 AP003026 AP000446 D11S873 D11S1775 D11S4187 D11S1306 AP000852 AP001825 AP000857 AP000639 AP003093 AP003095 AP002803 C T Non Del Del Non Inf D11S1979 D11S 4135 est délété Tester D11S1795, D11S1354 et/ou D11S1979 pour déterminer la borne télomérique