1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

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1 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains
Protocole d’étude du potentiel chondroprotecteur des eaux minérales in vitro Jean Cambar, Béatrice L’Azou, Christian Toussaint, Céline Ohayon Faculté de Pharmacie – EA 3672 Université Victor Segalen - Bordeaux 2, France

2 Le contexte : le thermalisme et l’arthrose
Orientation Rhumatologie : curistes (30% de la fréquentation) Arthrose : curistes (60% des curistes en RH) Avantages du thermalisme Baisse de la douleur Diminution de la consommation de médicaments Traitement non agressif Mécanismes d’action ? Techniques thermales, prise en charge globale du patient.. Propriétés physiques et/ou chimiques des produits thermaux Besoins exprimés par les instances d’avoir des études cliniques et des études de SMR. Nous avons proposé une voie complémentaire, entrant dans les axes de recherche de l’AFRETH, d’études explicatives. 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

3 La démarche générale de notre équipe
Hypothèse : certains éléments minéraux connus pour leur tropisme pour les os et le cartilage, auraient des propriétés anti-arthrosiques. Approches envisagées Étude du passage transcutané des éléments contenus dans l’eau minérale et la boue thermale (cuivre, zinc, strontium, manganèse …) Recherche de l’activité in vitro de ces éléments sur des modèles cellulaires pertinents 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

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Passage transcutané Le passage transcutané d’éléments des eaux minérales a déjà été mis indirectement en évidence Par traceurs radioactifs (Dubarry, Tamarelle, ) Par mesure des niveaux sériques (Sukenik, 1992) Protocole de nos études antérieures Cellule de diffusion (Franz) sur peau humaine avec compartiment de recueil contenant du plasma humain Modalités expérimentales proches des pratiques thermales (applications répétées de boue ou d’eau) Dosage spectrométrique des éléments dans le plasma de recueil Aucun passage : fer, sodium, potassium, chlorure, calcium Passage : manganèse, strontium, zinc et cuivre Donner des valeurs chiffrées du passage 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

5 Arthrose et modèles cellulaires in vitro
Mécanismes de l’arthrose encore mal connus Principalement lié à un dysfonctionnement de la cellule constitutive du cartilage, le chondrocyte Déséquilibre entre les phénomènes d’anabolisme et de catabolisme du cartilage articulaire : le chondrocyte est anormalement stimulé et dysrégulé. Dans le cas de l’arthrose, les chondrocytes peuvent produire des cytokines pro-inflammatoires provoquant la destruction du cartilage par augmentation de la synthèse et de l'activité, notamment : • des métalloprotéinases (stromélysine, gélatinase, collagénase) • des hyaluronidases • et d'une ou des agrécannase(s). Ces enzymes, sécrétées par le chondrocyte, sous forme inactive dans la matrice, vont avoir une activité excessive liée à une augmentation de leur synthèse et à un défaut de leur inhibition par les Tissue Inhibitors of Metalloproteases (TIMPs). De ce fait, les propriétés mécaniques du cartilage se détériorent, ce qui peut expliquer la dégénérescence arthrosique. L’utilisation de cultures cellulaires de chondrocytes représente un modèle d’étude pour mettre en évidence les modifications métaboliques survenant dans le cartilage. 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

6 Intérêt des modèles in vitro
Contributions reconnues et déjà validées des modèles in vitro en pathologie et en thérapeutique. Déjà des références en thermalisme avec des modèles de fibroblastes, de cellules musculaires,.. Corrélations avec les études sériques de marqueurs de l’inflammation chez des patients arthrosiques; 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

7 Présentation du projet
Choix des éléments à tester : Sr et Mn Choix du modèle cellulaire : chondrocytes humains sains en primoculture Objectifs Valider le modèle cellulaire (amplification et différentiation) Déterminer la viabilité et la prolifération cellulaires en présence de Sr et de Mn (pour définir les doses et la durée d’exposition) Caractériser certains marqueurs de la matrice extracellulaire Mesurer l’effet du Sr et Mn sur la balance synthèse/dégradation des constituants de la MEC Étude retenue par l’AFRETH pour un financement d’une durée de 1 an Valider le modèle de culture de chondrocytes Définir des marqueurs pertinents. • Mise en culture de chondrocytes et amplification cellulaire • Étude de la viabilité cellulaire en présence de strontium et de manganèse sur culture de chondrocytes normaux, afin de déduire des doses pharmacologiquement actives • Évaluer l’action du strontium et du manganèse sur le métabolisme cartilagineux. • Étude des cytokines ou médiateurs impliqués dans la synthèse de la matrice extracellulaire et mise en évidence de la pertinence des biomarqueurs à étudier 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

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Choix des éléments Le strontium cation bivalent avec une forte affinité pour l’os, effet bénéfique, soit sur la production de la MEC (stimule la production de protéoglycannes), soit par inhibition de la dégradation du cartilage dans l’arthrose, Le manganèse rôle dans la constitution d’enzymes et de métalloenzymes, optimise la production des glycosaminoglycannes et donc des protéoglycannes, Vérifier l’action du strontium, du manganèse et de leur association sur cultures de chondrocytes humains 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

9 Choix du modèle cellulaire
Primoculture de cellules cartilagineuses humaines saines Disponibles dans le commerce Garanties pour Conservation du phénotype si ≤ 10° doublement de population Production de collagène II 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

10 Objectif 1 : validation du modèle de culture
Difficultés : maintenir les chondrocytes dans un état différencié stable tout en permettant la multiplication des cellules Plusieurs modèles de cultures testés Choix de primo-cultures de chondrocytes de veau 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

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Choix du modèle Matériel facilement disponible : primocultures de chondrocytes de veau (A.M. Freyria, ibcp, Lyon) 1° approche : culture organotypique, culture sur biomatériaux ou sur gel, culture en suspension Maintien du phénotype Faible production de cellules Méthodes complexes Incompatibles avec les tests réalisés 2° approche : culture en monocouche sur des surfaces spécifiques (laminine, collagène I) Multiplication des cellules Méthodes plus simples Phénotype instable Agarose 2% Laminine Collagène I Ac Coll. I 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

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Choix du modèle 3° approche : culture en monocouche sur plastique Méthodes plus simples,compatibles avec nos études Augmentation du pouvoir prolifératif Phénotype variable selon l’origine des cellules (espèces, âge) et la densité cellulaire Approche retenue : culture en forte densité, en vérifiant le phénotype (méthodes immunochimiques et de biologie moléculaire) Faible densité Forte densité 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

13 Objectif 2 : études de la viabilité
Permettent de déterminer les doses de Sr et Mn non toxiques à utiliser et de quantifier un éventuel pouvoir prolifératif. Phase préliminaire sur lignée de cellules mésangiales humaines (IP15) Matériel cellulaire disponible au laboratoire en grande quantité (lignée stable) Matériel humain produisant de la matrice extracellulaire Phase de confirmation sur chondrocytes de veau 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

14 Résultats de viabilité cellulaire (IP15)
Méthodologie : Utilisation d’un colorant vital (rouge neutre) Mesure de l’intégrité membranaire (lysosomes) Évaluation du nombre de cellules vivantes 24 h 72 h 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

15 Résultats de la prolifération cellulaire (IP15)
Méthodologie : Utilisation d’un colorant vital (rouge neutre) Mesure de l’intégrité membranaire (lysosomes) Évaluation du nombre de cellules vivantes en fonction du temps 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

16 Confirmation des résultats sur chondrocytes
Le Sr et le Mn n’induisent aucune mort cellulaire, ni prolifération cellulaire, quelle que soit la dose utilisée. Choix des doses de l’étude Sr : 0,01 - 0,1 et 1 mg/ml Mn : et 100 µg/l Choix de la durée d’exposition 72 h, 7 j et 21 j Compatibles avec les résultats des études du passage transcutané et les pratiques thermales 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

17 Objectif 3 : marqueurs de la MEC
Mise en évidence et quantification des constituants majoritaires de la MEC synthétisés par les chondrocytes (libérés dans le surnageant et/ou ancrés sur les cellules) Collagènes méthode biochimique colorimétrique (rouge de Sirius, kit Biocolor, Sircol™) quantification de tous les collagènes solubles Protéoglycannes méthode biochimique colorimétrique (bleu de méthylène, kit Biocolor, Blyscan™) quantification des glycosaminoglycannes sulfatés 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

18 Résultats de l’étude des marqueurs de la MEC
Niveau basal des GAGs (veau et homme) Niveau basal Collagène Niveau basal très élevé (biais méthodologique, présence de collagène dans le milieu de culture) Nécessité de mettre en œuvre la RT-PCR pour utiliser ce marqueur 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

19 Objectif 4 : effet du Sr et Mn sur la MEC
Cellules de chondrocytes de veau Pas de modification du niveau basal Pas d’action cellulaire directe sur les marqueurs choisis Envisager d’autres marqueurs comme les cytokines pro-inflammatoires (MMP, TIMPs) et les IL. 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

20 Effet du Sr et Mn en présence d’IL-1
Nécessité de mettre en œuvre une autre approche : effet potentiel de restauration en présence d’agents catabolisants (IL-1) pour mimer les chondrocytes arthrosiques. 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

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Conclusion Cette étude réalisée in vitro sur chondrocytes permet de disposer d’un modèle d’étude rapide de l’effet des éléments minéraux contenus dans les produits thermaux, d'étudier l’effet de ces éléments sur la production des constituants majoritaires de la matrice extracellulaire, d’évaluer leur effet sur la balance synthèse/dégradation de la MEC Mais, il sera nécessaire de mettre en œuvre des moyens supplémentaires (de biologie moléculaire, d’immuno-histochimie et biochimiques) pour approfondir les mécanismes impliqués. 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains