Laboratoire d’Optique et Biosciences

Présentation au sujet: "Laboratoire d’Optique et Biosciences"— Transcription de la présentation:

1 Laboratoire d’Optique et Biosciences
Thèse Présentée par Thomas Polack Spectroscopie infrarouge impulsionnelle appliquée au transfert de ligands dans les hémoprotéines préparée au Laboratoire d’Optique et Biosciences Thèse préparée au LOB sous la direction de AA. Elle a pour titre …. Directrice de thèse Antigoni Alexandrou

2 Plan de la présentation
Transfert de ligands dans les hémoprotéines Différentes approches expérimentales Expériences pompe-sonde spectralement intégrées Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions et Perspectives

3 Plan de la présentation
Transfert de ligands dans les hémoprotéines Approches expérimentales Expériences pompe-sonde spectralement intégrées Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions et Perspectives

4 Transfert de ligands Transport, stockage, catalyse
enzymatique, détection de ligands Liaison du ligand à l’hème → fonction de la protéine Dynamique du transfert du ligand site de liaison ↔ extérieur Sonder le transfert : rayons X absorption transitoire visible → transitions électroniques de l’hème absorption transitoire infrarouge → vibration du ligand F. Schotte, M. Lim, T. A. Jackson, A. V. Smirnov, J. Soman, J. S. Olson, G. N. Phillips Jr., M. Wulff, P. Anfinrud, Science 300, 1944 (2003). Les hémoprotéines (diatomics O2 CO NO CN) À quoi elle servent ? -> Transport, stockage... Rôle de l’hème dans la fixation Binding = function IR tool : visualize ligand only (vs visible pump-probe experiments) The binding of ligands (O2, NO, CO) in heme proteins is an integral part of many biological functions such as storage and ligand transport, enzymatic catalysis and ligand detection A thorough knowledge of the mechanisms underlying the ligand transfer from the heme binding site to the protein exterior is essential to understand how these heme proteins accomplish their function

5 Motivations Compréhension du processus de transfert entre la poche de l’hème et l’extérieur de la protéine → Premières étapes du transfert Accès aux caractéristiques vibrationnelles du ligand aux temps courts Détection du champ émis : intervention de mouvements concertés dans le processus de transfert

6 Myoglobine : de l’hème au docking-site
Olson et al. Biochemistry (1994) Elber et al. Biophys. J. (1998) B1 O Côté distal C Transfert Côté proximal CO lié à l’hème CO au docking-site States = different conformations Different positions of the residues Pump induced dissociation (400 nm) B states : also different configurations B1 and B2 oppposite orientations Dissociation déclenchée par une impulsion pompe visible dans la bande de Soret à 400 nm.

7 Modification de la vibration
Caractéristiques infrarouges du transfert Δα CO lié à l’hème Ligand CO Vibration en dehors du continuum des autres modes vibrationnels de la protéine Forte absorption Modification de la vibration 1945 → 2130 cm-1 Diminution force d’oscillateur d’un facteur 30 Changement d’orientation Temps de déphasage ~1ps Anfinrud et al. J. Chem. Phys. (1995) CO sur le docking-site Δα ┴ wavenumbers CO vibrational transition depends on the CO state myoglobin Up to now, no intermediate frequency have not been reported Free induction decay spectral oscillations due to long dephasing time of the CO Smaller dipole : smaller charge displacement ║ B1 B2 Anfinrud et al., Nat. Struct. Biol. (1997)

8 Effets de polarisation perturbée
T2 ~1ps Délai pompe-sonde négatif Polarisation perturbée par la pompe Oscillations spectrales Dynamique aux temps courts Domaine temporel M. Joffre et al. Opt. Lett Polarisation P DP Polarisation perturbée par la pompe Domaine spectral Transmission différentielle intégrées spectralement → signal faible Détection du champ émis

9 Plan de la présentation
Transfert de ligands dans les hémoprotéines Approches expérimentales Expériences pompe-sonde spectralement intégrées Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions et Perspectives

10 Montage expérimental IR OPA l/2 Ds = 100 cm-1 1.2-2.4 µm 100 nJ AgGaS2
Verdi 10 W µm RegA RegA RegA 6 µJ 4 µJ 4 µJ BBO BBO 100 kHz, 150 fs 200 kHz, 150 fs 200 kHz, 150 fs 100 nJ Coherent Coherent Coherent Amplificateur Régénératif Regen. Amp. Regen. Amp. Signal Vitesse Mira Mira 800 nm, 5 nJ BBO l/2 80 MHz, 100 fs Pompe 400 nm 200 fs 250 nJ Coherent Coherent Coherent Idler Oscillateur Oscillator Oscillator Délai pompe-sonde Ds = 100 cm-1 IR AgGaS2 Différence de fréquence 3-18 µm, 250 fs, 40 pJ Détecteur HgCdTe Interféromètre Translation-Rotation de l’échantillon

11 Plan de la présentation
Transfert de ligands dans les hémoprotéines Approches expérimentales Expériences pompe-sonde spectralement intégrées Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions et Perspectives

12 Premiers résultats expérimentaux
4 D T/T x 10 5 3.5 Intégration spectrale Faible signal 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 Nécessité d’améliorer du rapport signal à bruit 0.0 -0.5 -1.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Délai pompe-sonde (ps)

13 Montage expérimental IR OPA l/2 1.2-2.4 µm 100 nJ AgGaS2 Détecteur
Verdi 10 W µm RegA RegA RegA 4 µJ 4 µJ 6 µJ BBO BBO 100 kHz, 150 fs 200 kHz, 150 fs 200 kHz, 150 fs 100 nJ Coherent Coherent Coherent Amplificateur Régénératif Regen. Amp. Regen. Amp. Signal Vitesse Mira Mira 800 nm, 5 nJ BBO l/2 Pompe 400 nm 200 fs 250 nJ Coherent Coherent Coherent 80 MHz, 100 fs Idler Oscillateur Oscillator Oscillator Délai pompe-sonde IR AgGaS2 Détecteur HgCdTe Interféromètre Translation- Rotation de l’échantillon

14 Détection différentielle infrarouge
Hacheur mécanique haute fréquence Intensité de référence Laser (100 kHz) Faisceau pompe 50 kHz Intensité de référence AgGaS2 IR Détection synchrone Détecteur HgCdTe Echantillon Intensité sonde transmise

15 Plan de la présentation
Transfert de ligands dans les hémoprotéines Approches expérimentales Expériences pompe-sonde spectralement intégrées Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions

16 Sondes Infrarouges et absorption du ligand
2 1 3 Intensité (unités arbitraires) CO lié à l’hème CO sur le docking site Change figure spectrum 3 + structure These are the parameters used in the simulations B1 and B2 These gaussians indicate the position of the CO absorption 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 Sonde Ds = 100 cm-1 1945 2130 cm-1 Nombre d’onde nombre d’onde ( cm-1)

17 Transmission différentielle dans MbCO
x 10 -4 1945 2130 1 2 3 1.5 Fréquence finale 2120 cm-1 1 -ΔT/T ║ 0.5 ║ Fréquence intermédiaire 2060 cm-1 -0.5 Aucun signal observé dans deoxymyoglobine -1 -1.5 Fréquence initiale 1945 cm-1 Gaas reference signal deoxyMb control experiments Magic angle experiments Include little probe and Matches the absorption strength difference ???? Positive signal probe 1???? ┴ -2 Pompe 400 nm Sonde IR -1500 -1000 -500 500 1000 1500 2000 Délai pompe-sonde (fs)

18 Absorption différentielle
-4 Fréquence finale Fréquence initiale Angle Magique Pompe 400 nm Sonde IR

19 Plan de la présentation
Transfert de ligands dans les hémoprotéines Approches expérimentales Expériences pompe-sonde spectralement intégrées Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions

20 Modèle Phénoménologique :
Simulations Modèle Phénoménologique : Polarisation induite linéairement par la sonde Modèle à 2 niveaux équations de Bloch Variation fréquence force d’oscillateur temps de déphasage orientation 1900 2000 2100 2200 Nombre d’onde (cm-1) Supprimer broadening Values from Anfinrud (34)

21 Changement instantané de force d’oscillateur
-4 D Expérience Simulation Fréquence finale Fréquence initiale → Changement abrupt de la force d’oscillateur n’est pas compatible avec l’expérience

22 Changement progressif de force d’oscillateur
-4 D Expérience Simulation Fréquence finale Fréquence initiale → Temps caractéristique de la diminution de la force d’oscillateur : 400 fs

23 Changement de fréquence vibrationnelle progressif
-4 D Expérience Simulation Fréquence finale Fréquence initiale → Moins bon accord avec les expériences

24 Effet d’un élargissement spectral
-4 Avec élargissement Sans élargissement D Fréquence finale Fréquence initiale → Influence faible pour un élargissement inférieur à la largeur du spectre de sonde

25 Expériences intégrées spectralement
Changement de fréquence quasi-instantané Diminution progressive de la force d’oscillateur Faible influence de l’élargissement spectral Nouvelle observation Compatible avec les résultats de Anfinrud et al Indicateur de la distance Hème-CO Nécessité de calculs de force d’oscillateur → Utilisation de la force d’absorption comme sonde du transfert

26 Plan de la présentation
Transfert de ligands dans les hémoprotéines Approches expérimentales Expériences pompe-sonde intégrées spectralement Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions

27 Champ transmis et Champ rayonné
EIncident ETransmis Transmission |ET |2 ET = EI + ER t Champ émis ER ERayonné

28 Expériences de détection du champ émis
EPOMPE Eréférence t Eexcitation Nécessité d’un contrôle de la phase fref - fexc

29 Plan de la présentation
Transfert de ligands dans les hémoprotéines Approches expérimentales Expériences pompe-sonde spectralement intégrées Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions

30 Montage expérimental IR OPA l/2 1.2-2.4 µm 100 nJ AgGaS2 Détecteur
Verdi 10 W µm RegA RegA RegA 4 µJ 4 µJ 6 µJ BBO BBO 100 kHz, 150 fs 200 kHz, 150 fs 200 kHz, 150 fs 100 nJ Coherent Coherent Coherent Amplificateur Régénératif Regen. Amp. Regen. Amp. Signal Vitesse Mira Mira 800 nm, 5 nJ BBO l/2 Pompe 400 nm 200 fs 250 nJ Coherent Coherent Coherent 80 MHz, 100 fs Idler Oscillateur Oscillator Oscillator Délai pompe-sonde IR AgGaS2 Détecteur HgCdTe Interféromètre Translation-Rotation de l’échantillon

31 Montage expérimental t t Deux générations IR
AgGaS2 échantillon AgGaS2 Deux générations IR Phase relative difficile à stabiliser Détecteur HgCdTe Modification de la configuration expérimentale

32 Montage expérimental fpompe fexcitation Détection synchrone
HeNe PZT Microcontrôleur AgGaS2 échantillon Détecteur HgCdTe Impulsion de référence engendrée dans le même cristal Interferomètre asservi → Impulsions vérrouillées en phase Détection synchrone à la somme de fréquence fpompe + fexcitation Impulsion de référence engendrée dans le même cristal Impulsion de référence engendrée dans le même cristal Interferomètre asservi → Impulsions vérouillées en phase

33 Deux approches possibles
Détection homodyne référencée j t Détection homodyne auto-référencée → facilité de mise en oeuvre d w0t Dt Df = w0Dt Df = 0 Df = p/2 Plus dur d’asservir à tous les délais qu’à un unique délai, on a seulement besoin de faire bouger la pompe t

34 Plan de la présentation
Transfert de ligands dans les hémoprotéines Approches expérimentales Expériences pompe-sonde spectralement intégrées Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions et Perspectives

35 Expérience de détection du champ émis
Expériences de détection du champ émis Expérience de détection du champ émis pompe pompe Changement avec la phase Contribution pompe-sonde Impulsion excitatrice excitation référence excitation référence 500 fs t t

36 Plan de la présentation
Transfert de ligands dans les hémoprotéines Approches expérimentales Expériences pompe-sonde spectralement intégrées Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions et Perspectives

37 Conclusions Expériences pompe-sonde spectralement intégrées
Mesure l’absorption intégrée et le décalage en fréquence Expérience adaptée aux grands changements de fréquence > 100 cm-1 (myoglobine) Mise en évidence d’une décroissance non-instantanée de la force d’oscillateur, c’est une nouvelle observation Utilisation de cette force d’oscillateur comme sonde du transfert Expériences de détection du champ émis Démonstration expérimentale Expérience adaptée aux faibles changements de fréquence et transfert cohérent

38 Perspectives Etude du transfert de ligand dans diverses hémoprotéines à l’aide des méthodes développées Expérience de détection du champ émis dans la cytochrome c oxydase Ursula Liebl and Gérard Lipowski and Michel Négrerie and Jean-Christophe Lambry and Jean-Louis Martin and Marten H. Vos, Nature 401 (1999) nFe=1962 cm-1 → nCu=2062 cm-1