Modèles d’étude Synechococcus sp. WH8102 Prochlorococcus MED4 Impact des radiations UV sur les communautés cyanobactériennes Abondants dans les eaux oligotrophes.

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1 Modèles d’étude Synechococcus sp. WH8102 Prochlorococcus MED4 Impact des radiations UV sur les communautés cyanobactériennes Abondants dans les eaux oligotrophes Concentration : souvent > a 10 5 cell.ml -1 Distribution verticale : de 1 à 100 m Ecotype de surface Génome disponible Abondants dans les eaux mésotrophes et oligotrophes Distribution verticale : peu abondant < 100 m Ecotype pélagique Génome disponible Manipulable génétiquement Approches Etudier l’effet des UV sur la photosynthèse, le cycle cellulaire et la réparation des dommages à l’ADN dans différentes conditions de culture. Identifier de nouveaux gènes impliqués dans la résistance aux UV (Gel 2D, Microarrays). Mise au point de marqueurs du stress UV applicables en milieu naturel.

2 Samuel Chaffron (MST, Mise en place du Turbidostat) Alexis Dufresne (Thèse, Bioinformatique) Chistophe Six (Thèse, Protéomique) Ludovic Chopin (DEA, Biologie Moléculaire) Julia Holtzendorff (Post doc, Biologie Moléculaire) Dominique Marie (IE, Cytométrie en Flux) Laurence Garczarek (CR1, Biologie Moléculaire) Jean-Francois Lennon (CR1, Physicien) Fredéric Partensky (DR2, Coordinateur) Participants pour la Station Biologique de Roscoff

3 Cyclostat en lumière jour-nuit modulée (PAR + UVA + UVB) Microarrays : Complet et/ou miniarray (environ 150 gènes) Gènes photosynthétiques : Centres Réactionnels, Phycobilisomes, Synthèse des pigments (chlorophylle, caroténoides), Gènes de stress lumineux (HLIP) Réparation des dommages à l’ADN Antioxydants Protéines Heat shock Systèmes à deux composants Transcription/Machinerie régulatoire Fixation du carbone Intégrité membranaire Synthèse protéique Expérience de shift ou acclimatation de Synechococcus à différentes lumières (UVA, B) Genétique sur Synechococcus (Mutants ponctuels, librairies de mutants) Biosenseur en temps réel (utilisant le gène recA ?) Expériences Prévues dans le Cadre d’UVECO

4 Construction du Cyclostat xx CULTURE PAR PRELEVEMENTS POUBELLE MILIEU DE CULTURE x Pompes péristaltiques UVA, UVB Niveau d’éclairement Temps (heures) 186 6 6 6 0 1500 μE UVA UVBPAR Photodiodes

5 Construction du Cyclostat xx CULTURE Prélèvement automatique des échantillons POUBELLE MILIEU DE CULTURE x Pompes péristaltiques Bain circulant Thermostaté

6 Paramètres étudiés à partir du Cyclostat Cytométrie en Flux : Croissance et cycle cellulaire Formation intracellulaire de composés d’oxygène réactifs ? Gels 2D Identification de protéines différentiellement exprimées PCR Quantitative Expression de différents gènes impliqués dans la photosynthèse, la photoprotection, le cycle cellulaire et la formation de dommage à l’ADN Microarrays (Mise en évidence de nouveaux gènes impliqués dans la résistance aux UV) Péroxydation des lipides membranaires (dosage a l’acide thiobarbiturique) Dosage des groupements -SH (C. Six) Composition pigmentaire (HPLC, spectrofluorimétrie, C. Six, F. Lantoine) Variation des paramètres photosynthétiques (P. Conan) ? Dommages à l’ADN (dosage des CDPs, F. Joux) Modifications biochimiques (sucres, acides aminés, R. Sempéré)

7 Volumes prélevés et fréquence des prélèvements sur le cyclostat Méthodes d'analyses Volumes Prélevés Cytométrie en Flux (D. Marie) Croissance, cycle cellulaire, 2 x 1 ml Espèces réactives de l'O2 toutes les 30 min Analyse pigmentaire (C. Six, F. Lantoine) HPLC 3 x 50 ml Spectrofluorimétrie 1.5 ml Mycosporines ? Paramètres photosynthétiques (P. Conan) ? ARN (L. Garczarek) Microarrays + PCR Q 700 ml Gels 2D (C. Six) 2 ou 3 points/jour Exp indép Groupements –SH (C. Six) ? Dimères de thymidine/ Protéines carbonylées (F. Joux) ? Dommages lipidiques (C. Six ou F. Joux) ? Malondialdehyde Modifications Biochimiques (R. Sempéré) ? Sucres, acides aminés Growth irradiance (µE.m- 2.s- 1 ) 0 1500 750 Time 18:006:0018:006:00 Points de prélèvement 6h, 9h, 12h, 15h, 18h, 22h, 2h Volume Maximum prélevé = 900 ml/ point

8 Calendrier récapitulatif 12341234123412 Developt 2D & QPCRXXXX Developt du cyclostat UV-visibleXX Etudes physiologiques cyclostatXXXXXXX Effets UV SynechococcusXX Mutants ponctuelsXXXXXXXXX MicroarraysXXXXXXXX Biosenseurs en temps réelXXXX Analyse échantillons naturels Biosope XXXXXXX 2003200420052006

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12 Macroarray Gene Selection Model : Synechococcus WH8102 2 Arrays : Photosynthesis/Photoprotection/UV stress Small ORF in Synechococcus (< 100 Amino Acid) Structure : Hybridization/Scanning : Genopole Grand Ouest (Plateform of Rennes) Laboratory of Frédérique Hubler Bioinformatic/Statistic Treatment : Genopole Grand Ouest (plateform of Nantes) Conditions : First array limited to 100-150 genes Oligonucleotide/PCR product ? Control:Stress: Cy3/Cy5

13 Thylacoïdale Membrane D1 CP47 CR II CP47 CP43 D2 D1 D2 Photosystem II Photosystem I Allophycocyanin Phycoerythrin Phycocyanin CR I PsaAPsaB PsaM Phycobilisomes PsaI/L PsaF/J Stroma Lumen Photosynthetic genes Gene Name 1photosystem II D1 protein form IIpsbA2 2photosystem II D2 proteinpsbD1 3photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein subunit psaA Ia (PsaA) 4photosystem II chlorophyll-binding protein CP43psbC 5photosystem II chlorophyll-binding protein CP47psbB

14 Pigment synthesis Gene name 6 chlorophyll synthase 33 kD subunitchlG 7 possible light-dependent protochlorophyllide oxido-reductasepcr, por 8 light-independent protochlorophyllide reductase subunit B chlB 9 lycopene beta cyclasecrtL 10 beta-carotene hydroxylasecrtR 11 carotenoid binding proteinor0312 12 possible beta-carotene ketolase or0313 13 conserved hypothetical proteinor0315 lycopene γ-carotene β-carotene β-cryptoxanthin zeaxanthin lycopene β cyclase β-carotene hydroxylase Chlorophyll a 2 Chlorophyllide a 2 DV-Protochlorophyllide a 2 Chlorophyll synthase Protochlorophyllide reductase (or0544, or0545, or0545) Protochlorophyllide oxydoreductase (or0543, or0791, or1537) Chlorophyll synthesis Carotenoids synthesis