dans la viande: Quelles sont les dernières découvertes ?

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1 dans la viande: Quelles sont les dernières découvertes ?
Escherichia coli O157:H7 et les Escherichia producteurs de Shigatoxines (STEC) dans la viande: Quelles sont les dernières découvertes  ?

2 Intoxication au steak haché
Seize enfants ont été hospitalisés pour une « intoxication alimentaire grave » après avoir consommé des steaks hachés surgelés distribués par Leclerc, dans 19 départements du Sud Ouest. 25 Oct. 2005

3 Alerte à la viande avariée en France (24/03/08)
                                                                                                                                     (24/03/08)

4 Multiplication bactérienne non nécessaire, contamination suffisante!!!
DOSES INFECTIEUSES TRES BASSES QUELQUES BACTERIES /25 g Multiplication bactérienne non nécessaire, contamination suffisante!!! Acidoresistance !!

5 La coupable !!

6 Comment faire ?????

7 Vers une nouvelle classification des souches pathogènes ?

8 Lésions d ’attachement et d’effacement
(Knutton et al, Infect. Immun. 1987) gène eae ( LEE sur îlot de pathogénicité PAI III) (nombreux variants !!) Production de verotoxines = shigatoxines ( gène stx)

9 Verotoxine ou shigatoxine
Nouvelle dénomination Ancienne dénomination gène protéine Toxine de Shiga stx Stx 99 % d'homologie Toxine Shiga-like de type I ou (SLT-I) ou vérotoxine 1(VT1) stx1 Stx1 55 % d'homologie SLT-II ou VT2 stx2 Stx2 SLT-IIc/d ou VT2c/d stx2c/d Stx2c/d 90% d'homologie stx 2e/f Stx2e/f SLT-II/f ou VT2e/f Autres variants décrits très récemment : stx2 g, . stx2-NV206

10 Autres sérotypes..mais liste non exhaustive
Sérotype O157:H7 Autres sérotypes..mais liste non exhaustive Stx2 et eae et SHU : (Ethelberg et al (Danemark), Tarr et al. 2005, Karmali 2004 Marqueur de virulence des STEC ? Acidoresistance ???

11 Définition actuelle de l’AFSSA
SOUCHE STEC PATHOGENE Définition actuelle de l’AFSSA Appartient aux sérogroupes O157:H7, O26, O103, O111 ou O145 ET Stx+ et eae+

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15 Approche MRA molecular risk assessment (Coombs et al 2008) Congrés du PEN 4-5 mars 2008 à Rome
Îlots de pathogénicité, O-Island Séropathotype Variants eae , stx

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22 DETERMINATION DES FACTEURS DE VIRULENCE
flagelle H11 eae (variants) stx commun, stx 1 et stx 2 et variants stx2 Îlot O122: Z4321, Z4326, Z4332, Z4333

23 Z4332 Z4321 Z4333 Z4326

24 Les « EHEC typiques » EHEC O157:H7 = rfbEO157, flicH7, stx1 et/ou stx2, eae-gamma, O#122. EHEC O26:H11 = wzxO26, flicH11, stx1 et/ou stx2, eae-beta, O#122. EHEC O145:H28 = ihp1O145, flicH28, stx1 et/ou stx2, eae-gamma, O#122. EHEC O103:H2 = wzxO103, flicH2, stx1 et/ou stx2, eae-epsilon, O#122. EHEC O111:H8 = wbd1O111, flicH8, stx1 et/ou stx2, eae-theta, O#122.

25 SOUCHE STEC PATHOGENE Définition de l’AFSSA
Appartient aux sérogroupes O157:H7, O26, O103, O111 ou O145 ET Stx+ et eae+ Mais définition en cours de révision par l’AFSSA (AST de la DGAL transmise début mai 2008)

26 Quels sont les E. coli que les industriels doivent prendre en considération dans leur plan HACCP, pourquoi ?

27 E. coli O157:H7 Séropathotype A stx+ et eae+ E. coli O26, O111,
stx+, eae+ Séropathotype B STEC (autres sérotypes)

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29 Quelles sont les méthodes de détection actuellement reconnues
Quelles sont les méthodes de détection actuellement reconnues ? Quel est le rôle du laboratoire national de référence dans la validation des méthodes de détection ?

30 E. coli O157:H7

31 Deux méthodes validées AFNOR en France et une norme ISO
Séparation Immunomagnétique (Dynabeads. Dynal) Norme ISO EN 16654 Méthode VIDASTM (bioMérieux) Méthode Bax (Oxoid)

32 (microscopie électronique)
Bactéries E. coli O157 et billes magnétiques (microscopie électronique)

33 VIDAS biomérieux

34 VIDAS: Sample preparation
Heating step 15 min 95°C 45min Test

35 )                                                                                BAX Oxoid

36 REAL TIME PCR: Sample preparation
Lysis buffer Sample 20min 37°C min 95°C min 4°C Bacterial lysis mix PCR PCR

37 Real Time PCR: Sample preparation
45 min Bacterial lysis 3h 30min PCR

38 Enrichissement 8H pour les 2 méthodes
Taux de non isolement du pathogène après message présomptif (2à 5 pour 1000) pour le VIDAS, pas de recul en France pour le Bax Attention phase d’immunoconcentration nécessaire avant isolement !!! Prévoir IMS après le BAX Boites avec colonies suspectes à confirmer par le LNR

39 Utilisation des caractéristiques biochimiques de E
Utilisation des caractéristiques biochimiques de E. coli O157:H7 (Mutants!) sorbitol – b-glucuronidase – rhamnose – Résistance intermédiaire au céfixime et au tellurite

40 Milieu CT-SMAC Milieu CHROM agar Milieu O157:H7

41 Méthodes nouvelles.. Délai d’analyse <8h
Echantillon composite (375g)

42 METHODES DE DETECTION DES STEC non O157
AUCUNE CARACTERISTIQUE BIOCHIMIQUE COMMUNE !!!!!

43 eae +

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46 eae +

47 Inconvénients PCR (même en temps réel) signification d’un message positif. Genesystem Quid de l’enrichissement commun de l’ensemble des 5 sérogroupes de STEC ?? Non optimisé à ce jour Quid de l’isolement des souches STEC? (taux de confirmation??) Outil validé pour screening en PCR sur souches STEC pures mais validation nécessaire sur matrices

48 Résultats du Plan de surveillance VH surgelées 2007

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50 Taux de confirmation= 9%
3,7% Taux de confirmation= 9%

51 3354 échantillons analysés: PCR stx PCR eae PCR + pour les 5 sérogroupes d'intérêt parmi lesquels :  * 62  O103 : seulement 13 souches d‘E. coliO103 isolées dont 3 STEC pathogènes * 21  O157 : 5 souches d‘ E. coliO157:H7 isolées (pas d'autres O157 a priori) * 16  O26   : 6 souches d‘E. coliO26 isolées dont 2 STEC pathogènes (et 4 EPEC) * 14  O145 : 1 souche d‘ E. coliO145 isolées(EPEC mais non STEC pathogènes) *   8  O111 : 1 souche d‘ E. coli O111 isolées pathogènes.

52 A ce jour, il n’existe pas de méthode validée pour la détection et l’isolement des STEC pathogène Role du LNR =validation , existence de lignes directrices

53 Maîtrise du danger STEC par les professionnels

54 Où le gestionnaire du risque place t’il le curseur de la maîtrise du danger STEC dans la filière VH ? Risque épidémique (SHU) ? Risque sporadique (SHU) ?

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58 Maîtriser le risque épidémique de SHU
Contrôler individuellement chaque mêlée Et Lors de résultats d’autocontrôles positifs, établir la concentration du pathogène dans la mélée contaminée pour une maîtrise adaptée et plus pertinente

59 Gestion des résultats positifs par l’estimation de la concentration du pathogène

60 Un plan d’échantillonnage de 30 fois 25 grammes permet de quantifier la concentration dans la mêlée dans une gamme allant environ de 0,001 à 0,1 cellule par gramme.

61 30 échantillons de 25 g chacun puis regrouper (« pooler ») par 3 les échantillons de 25 g pour constituer des échantillons composites de 75 g soumis à l’analyse. On réduit ainsi par 3 le nombre d’analyses. La limite de détection de l’analyse est identique (Vimont A. et al. 2006)

62 Mêlée contaminée (un autocontrôle positif)
29 autres analyses sur 25 g ou 9 analyses sur 75g sur cette mêlée contaminée (total 30 ou 10) Si tous positifs Si au moins un négatif Contrôle mêlées aval + amont et cascade d’analyses si positif (arrêt quand négatif ou nettoyage désinfection) Plan d’échantillonnage 10 ou 30 Contrôle mêlées aval + amont et cascade d’analyses si positif (arrêt quand négatif ou nettoyage désinfection) Contrôle mêlées issues de la même matière première (+ cascades) Plan d’échantillonnage 10 ou 30

63 Perspectives Optimisation des méthodes de détection (rapidité , possibilité de tester des échantillons composites…) Attention !! La détection ne serait se substituer à la maîtrise de la contamination fécale lors de l’abattage-habillage des animaux Limitation du portage animal, animaux PROPRES à l’arrivée à l’abattoir, Hygiènes des opérations d’abattage, hygiène des hachoirs…)

64 Merci Pour votre Attention

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67 1.2 Calcul théorique de la probabilité de détecter E. coli
O157:H7 en fonction de la prise d’essai effectuée Selon la distribution de Poisson et en supposant une contamination homogène de la totalité de la mêlée : P= 1-e-(C*M) C, niveau de contamination et M, masse de steak haché Niveau de contamination de la mêlée (UFC E. coli O157:H7.g-1) Probabilité de détection de E. coli O157:H7 selon la prise d’essai réalisée (%) 25g 75g 125g 375g 750g (0,1 UFC/25g) 10 26 39 78 95 0,04 (1 UFC/25g) 63 99 99,99 100 0,1 92 99,9 1