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Le clonage
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Les enzymes de restriction
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X-gal: sélection bleu-blanc
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La production d’une molécule recombinante
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La production des molécules recombinantes-suite
-ligation avec l’ADN coupé avec un seul enzymepeut donner très peu de recombinantes -le rapport plasmide/insert est capital -traitement avec une phosphataseplus de recombinantes -couper les molécules d’ADN avec 2 enzymesplus de recombinantes -la température de la ligation: 20°C est mieux que 37°C -extrémités franches-ligation plus difficile: réduit la température et augmente le temp de ligation
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Digestion avec 2 enzymes
5’-----AAGCTT GAATTC ’ 3’-----TTCGAA CTTAAG ’ Plasmide avec une site HindIII et une site EcoR1 Digestion avec les deux enzymes…… 5’-----A AATTC ’ 3’-----TTCGA G ’ Une ligase ne peut pas mettre ces deux extrémités ensemble manque de compatibilité des nucléotides
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La transformation des bactéries -phase exponentiel -en présence de Ca++ à 4°C -choque thermique
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Gel d’agarose
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TP de clonage Premier jour
-digestion de l’ADN de la bactériophage lambda et l’ADN de pBS avec des enzymes Hind III et Eco R1 -inactivation des enzymes de restriction à 70°C -ligation des produits de la digestion -électrophorèse des produits de la digestion sur gel d’agarose -transformation des bactéries compétentes -étalage des bactéries sur les boîtes de petri amp/x-gal Deuxième jour -préparation des plasmides recombinantes -digestion de l’ADN des plasmides -électrophorèse des produits de la digestion -identification des fragments de l’ADN de la phage lambda clonés dans le plasmide
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